G試驗(yàn)-侵襲性真菌病的輔助診斷方法

湛江安度斯生物有限公司1唐麗娟容目錄一、真菌感染概一、真菌感染概述二、真菌與葡聚糖三、鱟試驗(yàn)與G試驗(yàn)四、G試驗(yàn)——臨床意義五、“生物探針”介紹六、“生物探針”操作流程七、“生物探針”的臨床比對八、G試驗(yàn)的影響因素湛江安度斯生物有限公司是查爾斯河公司設(shè)在中國的子公司，是中國細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試劑的最大供應(yīng)商，也是中國細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者和創(chuàng)新先鋒；世界著名的美洲鱟試劑（LAL）生產(chǎn)企業(yè)——美國CR恩度斯弗公司（CharlesRiverEndosafe,Inc.），也是查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司的子公司湛江安度斯的簡介CharlesRiverLaboratories作為全球最大的實(shí)驗(yàn)動物公司，CharlesRiverLaboratories一直是全球?qū)嶒?yàn)動物商業(yè)化繁育和市場供應(yīng)的領(lǐng)導(dǎo)者，擁有分布在北美、歐洲和日本的15個(gè)分設(shè)施和遍布全球的銷售網(wǎng)絡(luò)；已成為一個(gè)生物醫(yī)學(xué)前臨床產(chǎn)品和服務(wù)的主要供應(yīng)商。庫珀博士CREndosafe（恩度斯弗）公司是美國著名三大鱟試劑企業(yè)之一,有國際知名權(quán)威學(xué)者詹母斯弗.庫珀博士(Dr.JammesF.Cooper)創(chuàng)建。庫珀博士是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查研究領(lǐng)域的先驅(qū)。1971年他與Lein及Banger等人提出以鱟實(shí)驗(yàn)法檢查熱源，并率先證明了鱟實(shí)驗(yàn)法作為注射藥品熱源檢查的敏感方法的價(jià)值。1972年他協(xié)助美國(TheparentralDrugAssociation)的鱟試劑.他一直主持著美國非經(jīng)腸道藥物協(xié)會(TheparenteralDrugAssociatoin)的鱟實(shí)驗(yàn)應(yīng)用促進(jìn)工作,以及每年一屆的美國南卡羅納州查爾頓的鱟實(shí)驗(yàn)學(xué)術(shù)會議。庫珀博士創(chuàng)建的Endosafe公司現(xiàn)以成為美國鱟試劑(LAL)市場最大的供應(yīng)商.該公司的鱟試劑以其良好的穩(wěn)定性,廣泛的適用性以及優(yōu)越的抗干擾性能享譽(yù)國際醫(yī)藥工業(yè)界.一、真菌感染概述真菌感染：真菌感染在通常情況下我們最常見的是表皮的感染，例如頭癬、體癬、甲癬等，由于侵犯的部位大都表淺，不會導(dǎo)致嚴(yán)重問題，因而叫淺部真菌感染；深部真菌感染則是真菌突破人體天然屏障導(dǎo)致組織臟器的感染。7美國死于感染性疾病的十大原因820圍產(chǎn)期828真菌101053胃腸道1305圍產(chǎn)期91259結(jié)核1277肝膽管82370真菌1377胃腸道74596肝膽管1402細(xì)菌性腦膜炎65577心臟2333肺結(jié)核513,413腎臟/泌尿道2486心臟416,524HIV/AIDS8006腎臟/泌尿道322,396敗血癥9438敗血癥287,181呼吸道56,966呼吸道1死亡人數(shù)感染類型死亡人數(shù)感染類型19971980真菌感染的死亡率上升了3.4倍（死亡率：0.7~2.4/100,000）8EORTC/MSG原稱侵襲性真菌感染（IFI），修訂后改稱IFD；是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷的疾病。是真菌感染致死的重要原因侵襲性真菌病(InvasiveFungalDisease,IFD)9侵襲性真菌病已變得越來越常見10侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)G試驗(yàn)可作為擬診病例的微生物學(xué)標(biāo)志11主要可引發(fā)侵襲性真菌病的疾病腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤12二、真菌與葡聚糖2023/2/5131.某些真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)2.細(xì)胞壁含有葡聚糖組分的真菌：

（1）是導(dǎo)致侵襲性真菌病(IFD)的常見真菌。

（2）細(xì)胞壁有葡聚糖組分2023/2/514這類真菌有：

念珠菌

曲霉菌

耶氏肺孢菌

鐮刀酶

隱球菌接合菌.......2023/2/515北京301醫(yī)院尸檢結(jié)果（77～97年）肺真菌病發(fā)生率3.7％(38/1027)隱球菌病、接合菌病占真菌病比例不高16當(dāng)人體深部受這類真菌感染時(shí)，真菌在代謝過程會不斷釋放出葡聚糖。檢查患者的血液（血漿或血清），會發(fā)現(xiàn)葡聚糖含量明顯高于非感染者。因此，葡聚糖可作為具有這種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真菌感染標(biāo)識物。2023/2/517三、鱟試驗(yàn)與G試驗(yàn)1.鱟（Hòu，后）試驗(yàn)2023/2/518

鱟是地球上最古老的海洋生物之一，已有三億多年的歷史，人們稱它為“活化石”。雌雄2023/2/519研究發(fā)現(xiàn)，鱟的循環(huán)細(xì)胞（阿米巴細(xì)胞）中含有一種特殊的凝固酶原。這種凝固酶原可以被自然界廣泛存在的兩種物質(zhì)激活為凝固酶，從而導(dǎo)致一系列的生化反應(yīng)。這兩種物質(zhì)就是脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和(1-3)--D葡聚糖。2023/2/520

人們利用鱟的阿米巴細(xì)胞溶胞物制備成了鱟試劑（LAL或TAL）。通常稱使用鱟試劑檢測脂多糖（LPS）或-葡聚糖（-G）的試驗(yàn)為鱟試驗(yàn)（LALTestorTAL

Test）。2023/2/5212.鱟試驗(yàn)反應(yīng)機(jī)理223.鱟試驗(yàn)的應(yīng)用應(yīng)用I：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BacterialEndotoxinTest,BET)2023/2/523研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁都含有一種叫內(nèi)毒素(Endotoxin)的組分。2023/2/524

內(nèi)毒素是能夠引起哺乳動物原反應(yīng)的主要熱原物質(zhì)。革蘭氏陰性細(xì)菌在新陳代謝過程不斷地向環(huán)境釋放內(nèi)毒素，污染藥品和醫(yī)療器械。因此注射藥品和醫(yī)療器械都要求必須作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（BET）。2023/2/525應(yīng)用II：

革蘭氏陰性菌脂多糖檢測2023/2/526細(xì)菌內(nèi)毒素的化學(xué)成分是脂多糖。當(dāng)人體深部感染革蘭氏陰性菌時(shí)，細(xì)菌會在體內(nèi)不斷釋放內(nèi)毒素（脂多糖）。檢查患者的血液（血漿）、腹水、尿液及腦脊液，會發(fā)現(xiàn)脂多糖明顯高于非感染者。脂多糖檢測對敗血癥、嚴(yán)重器官衰竭的快速輔助診斷有臨床價(jià)值。2023/2/527應(yīng)用III：

真菌(1-3)--D葡聚糖檢測2023/2/528

醫(yī)學(xué)上通常把用于檢測真菌葡聚糖的鱟試驗(yàn)稱為G試驗(yàn)。這是取葡聚糖的英文名稱Glucan的首字母來命名該試驗(yàn)。2023/2/529需要指出的是，隱球菌的細(xì)胞壁雖然有葡聚糖組分，在隱球菌感染患者的血液中卻檢測不出葡聚糖異常。這可能與隱球菌具有特殊的細(xì)胞被膜有關(guān)。因此G試驗(yàn)不適合對隱球菌感染的檢測。2023/2/530四、G試驗(yàn)——臨床意義31G試驗(yàn)的臨床意義32G試驗(yàn)的臨床意義333435G試驗(yàn)應(yīng)用科室36五、“生物探針”介紹37“生物探針”介紹38“生物探針”介紹39“生物探針”介紹40“生物探針”介紹41“生物探針”功能快速定量的臨床檢測方法，幫助臨床醫(yī)生早期診斷目前常規(guī)方法難以判斷的侵襲性真菌感染、革蘭氏陰性菌感染，便于對感染的早期診斷、早期治療及對治療的療效判定?？蓹z測標(biāo)本：血漿、血清、尿液、腹水、腦脊液等42六、“生物探針”操作流程43“生物探針”操作流程44“生物探針”操作流程45“生物探針”操作流程46“生物探針”操作流程47“生物探針”操作流程48“生物探針”操作流程49“生物探針”操作流程50“生物探針”操作流程數(shù)據(jù)可接入LIS系統(tǒng)等51侵襲性真菌感染的臨床檢測方法對比52產(chǎn)品特點(diǎn)靈敏度高快速檢測方法嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確性高特異性好臨床符合率高53七、“生物探針”的臨床比對J廠家的-G試劑、LPS試劑均無特異性54最低檢測限最低濃度重復(fù)性廠商 安度斯 最低檢測限 10pg/ml編號 檢測結(jié)果(pg/ml) 陰性(pg/ml)

檢測日期1 10.3

<1.3

3.62 10.1

3 11.0 4 9.8 5 9.8 6 10.8 7 10.1 8 10.0 9 9.6 10 10.3

CV=6.85%11 10.0 12 9.8 13 10.7 14 9.8 15 12.4 16 10.3 17 9.7 18 9.6 19 9.4 20 9.9 21 9.6 批內(nèi)精密度批間精密度“生物探針”的臨床比對評價(jià)結(jié)論：安度斯產(chǎn)品的綜合性能具有明顯優(yōu)勢。58八、G試驗(yàn)的影響因素2023/2/5591.檢測試劑的靈敏度1.1葡聚糖的量值與標(biāo)準(zhǔn)品2023/2/5602023/2/561

目前G試驗(yàn)中葡聚糖采用的單位為重量單位“pg”。pg是一個(gè)非常非常微量的單位。因此G試驗(yàn)是一項(xiàng)非常靈敏的生物檢測。當(dāng)然，越是靈敏精確的檢測，越容易受到干擾。目前葡聚糖沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)！沒有國際標(biāo)準(zhǔn)品，沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品，也沒有公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，只有企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）2023/2/562各企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的來源不一。有的來自茯苓多糖，有的來自香菇多糖，有的來自海藻多糖。不同來源的葡聚糖對鱟試劑的活性不同。各企業(yè)的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)不一。你的1pg可能相當(dāng)我的10pg。相互之間無可比性。2023/2/563無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)致不同廠家試劑盒有不同的參考值。有的是10pg為陽性，有的是100pg為陽性。對參考值的表示各廠家也有所不同。有的以全血含量來表示，有的以檢測濃度來表示。2023/2/5641.2試驗(yàn)器具對G試驗(yàn)有重要的影響！葡聚糖是自然界廣泛存在的一種物質(zhì)，極容易污染到試驗(yàn)器具。葡聚糖是一種非常穩(wěn)定的物質(zhì)，通常的蒸煮高壓、輻照等滅菌手段不能徹底破壞葡聚糖。很難找到真正意義的無葡聚糖的器具。2023/2/565G試驗(yàn)使用到的實(shí)驗(yàn)器具：采血針采血管（瓶）反應(yīng)試管移液器具（吸頭）最主要的污染來自采血管！2023/2/566重要建議最好使用廠家供應(yīng)的專用采血管（瓶）其次是用經(jīng)廠家檢測合格的采血管不能使用未經(jīng)檢測的實(shí)驗(yàn)器具2023/2/567尊重科學(xué)，為患者負(fù)責(zé)！無效試驗(yàn)是對患者最大的危害！2023/2/5682.試劑的生物特異性

如前所述，G試驗(yàn)的檢測試驗(yàn)就是鱟試劑。鱟試劑可以對兩種物質(zhì)反應(yīng)，用于不同的用途。如下圖表示。

檢測內(nèi)毒素/脂多糖用于革蘭氏陰性菌檢測

鱟試劑

檢測葡聚糖（G試驗(yàn)）用于真菌檢測2023/2/569在檢測試劑制備上，應(yīng)根據(jù)試劑的用途制備生物特異性強(qiáng)的檢測試劑，如：用于檢測細(xì)菌脂多糖的試劑，不能對葡聚糖產(chǎn)生反應(yīng)。用于檢測真菌葡聚糖的試劑，不能對脂多糖產(chǎn)生反應(yīng)。2023/2/570

遺憾的是，由于技術(shù)的原因，并不是所有廠家的試劑都具有生物特異性。有的試劑盒對LPS和-G都反應(yīng)。有的試劑盒對非檢測對象低濃度時(shí)可能不反應(yīng)，較高濃度時(shí)會反應(yīng)。無生物特異性的試劑盒不能區(qū)分細(xì)菌感染和真菌感染，不具有臨床檢測價(jià)值！2023/2/5712023/2/572

鑒別試劑盒是否具有生物特異性的方法：用該試劑盒與LPS/-G的標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)控品）反應(yīng)。3.某些藥物對G試驗(yàn)的影響3.1臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，注射過香菇多糖注射液的供試者作G試驗(yàn)，其血液中葡聚糖含量會顯著增高。因此需要作G試驗(yàn)的供試者應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)避免使用香菇多糖注射液。2023/2/5733.2臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，使用過脂肪乳的供試者作G試驗(yàn)（包括作LPS檢測），反應(yīng)曲線形