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文檔簡介
第八章超敏反應及其疾病第一頁,共五十八頁,2022年,8月28日提要利用免疫學原理建立的免疫學檢測技術主要應用于對多種免疫性疾?。ǜ腥拘约膊 ⒚庖呷毕莶?、超敏反應、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反應和腫瘤等)的診斷、療效評估、發(fā)病機制探討、以及對抗原性物質或免疫細胞的定性、定量,對細胞因子、粘附分子及細胞受體的檢測等。第二頁,共五十八頁,2022年,8月28日第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原-抗體反應包括沉淀反應、凝集反應、溶解反應、補體結合反應和中和反應等??乖?抗體反應可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原;也可用已知的抗原檢測未知的抗體。免疫熒光技術、免疫酶技術、同位素標記技術、發(fā)光免疫分析等免疫標記技術提高了抗原抗體反應的敏感性。第三頁,共五十八頁,2022年,8月28日抗原-抗體反應的特點抗原-抗體的結合是特異性結合抗原抗體結合是分子表面的非共價鍵結合抗原抗體反應可分為兩個階段特異性結合階段可見的反應階段抗原和抗體結合是否呈現(xiàn)可見的反應現(xiàn)象,于兩者的分子比例密切相關第四頁,共五十八頁,2022年,8月28日抗原抗體比例對反應現(xiàn)象的影響第五頁,共五十八頁,2022年,8月28日抗原-抗體反應受多種因素影響1電解質:抗原-抗體反應通常應用0.85%的氯化鈉作為稀釋液,以供給適應濃度的電解質。2溫度:一般常使用反應在37度水浴或孵育箱中進行。3.酸堿度:抗原-抗體反應適應的酸堿度
為PH6~8。抗原-抗體反應受多種因素影響第六頁,共五十八頁,2022年,8月28日抗原抗體的檢測方法凝集反應沉淀反應補體溶血反應和補體結合反應中和反應用標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應第七頁,共五十八頁,2022年,8月28日凝集反應
(Agglutination)細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后形成凝集現(xiàn)象,稱為凝聚反應。1、直接凝集:將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應,出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集:將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面,與相應抗體反應出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。第八頁,共五十八頁,2022年,8月28日血球凝集第九頁,共五十八頁,2022年,8月28日
沉淀反應
(Precipitation)血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現(xiàn)沉淀物,這一類反應稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行,如絮狀沉淀。大多沉淀反應是用半固體瓊脂凝膠為介質,進行瓊脂擴散故也稱免疫擴散。第十頁,共五十八頁,2022年,8月28日單向免疫擴散
(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板,在適當位置打孔后將抗原加入孔中擴散。抗原在擴散過程中與凝膠中的抗體相遇,形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán),環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)第十一頁,共五十八頁,2022年,8月28日雙向免疫擴散
(DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中,二者自由向周圍擴散并相遇,在比例合適處形成沉淀線。如果反應體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng),則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關性分析的檢測。第十二頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫電泳
(Immunoelectrophoresis)是先將待側血清標本作瓊脂凝膠電泳,血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶,然后與電泳方向平行挖一小槽,加入相應的抗血清,把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散,在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析,以觀察Ig的異常增多或缺失。第十三頁,共五十八頁,2022年,8月28日火箭電泳(RocketElectrophoresis)
火箭電泳也稱免疫擴散,是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法。抗原在含有定量抗體的瓊脂中泳動,兩者比例適宜時,在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內,沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點是需時較短,故可用于快速沉淀標本中抗原的含量。第十四頁,共五十八頁,2022年,8月28日火箭電泳示意圖第十五頁,共五十八頁,2022年,8月28日補體結合反應(ComplementFixation,CFT)
敏感性和特異性均較高,但該試驗影響因素較多,現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢。第十六頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫標記技術用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體(或抗原)進行抗原-抗體反應。標記物質與抗體(或抗原)的化學連接未改變抗體(或抗原)的免疫學特性,同時標記物的性質依然存在,因而極大的提高了反應的靈敏度,可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術主要有三種基本類型:免疫熒光技術、免疫酶技術和同位素標記技術。第十七頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫熒光顯微技術
(ImmunofluorescenceTechnique)是用熒光素(常用的有異硫氰酸熒光素,F(xiàn)ITC)與抗體連接成熒光抗體,再與待測標本的抗原反應,,置熒光顯微鏡下觀察,抗原抗體復合物散發(fā)出熒光,借此對標本中的抗原作鑒定和定位。包括直接熒光法、間接熒光法和補體法。第十八頁,共五十八頁,2022年,8月28日直接熒光法:將熒光素直接標記抗體作標本染色。該法的優(yōu)點是特異性強,但其缺點是每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。間接熒光法:用一抗與標本中的抗原結合,再用熒光素標記的二抗染色。該法的優(yōu)點是敏感性比直接法高,制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測,但非特異性熒光亦會增加。補體結合免疫熒光法:此法是在間接法的第一步抗原—抗體反應時加入補體,使之與抗原——抗體復合物結合;再用熒光素標記的抗C3抗體進行示蹤。第十九頁,共五十八頁,2022年,8月28日間接免疫熒光法示意圖第二十頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫熒光顯微技術第二十一頁,共五十八頁,2022年,8月28日流式細胞術(FlowCytometry,FCM)
FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀,對單個細胞的表面標志(抗原或受體)進行快速、精確的分析和自動檢測,并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(shù)(如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等)進行多信息分析,為當代生命科學研究領域中廣泛使用的一項新技術。流式細胞術第二十二頁,共五十八頁,2022年,8月28日流式細胞儀工作原理第二十三頁,共五十八頁,2022年,8月28日酶免疫測定
(EnzymeImmunoassay,EIA)是用酶(常用的有辣根過氧化物酶,HRP和堿性磷酸酶,AP)標記的抗體進行的抗原抗體反應。EIA將抗原抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合,通過酶作用于底物后顯色來判定結果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法,前者測定可溶性抗原或抗體,后者測定組織中或細胞表面的抗原。第二十四頁,共五十八頁,2022年,8月28日酶聯(lián)免疫吸附試驗
(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應板)表面,使抗原抗體反應在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。第二十五頁,共五十八頁,2022年,8月28日ELISA檢測抗體第二十六頁,共五十八頁,2022年,8月28日第二十七頁,共五十八頁,2022年,8月28日放射免疫測定法
(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應的特異性結合,使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。第二十八頁,共五十八頁,2022年,8月28日
Ag*AbAg
標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標準曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性放射免疫測定法(RIA)示意圖第二十九頁,共五十八頁,2022年,8月28日RIA法原理及標準曲線
7550301001101001000未標記抗原濃度(ng/ml)結合/未結合的放射活性(%)第三十頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫印跡法(Immunoblotting)是將凝膠電泳與固相免疫測定結合,先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體,再用酶免疫、放射免疫等技術測定。該法能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量。常用于檢測多種病毒如HIV的抗體或抗原。第三十一頁,共五十八頁,2022年,8月28日免疫印跡法示意圖第三十二頁,共五十八頁,2022年,8月28日第二節(jié)淋巴細胞的測定
檢測各群體淋巴細胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本,但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結等作為標本進行檢查。第三十三頁,共五十八頁,2022年,8月28日(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后,緩慢加于分離液上第三十四頁,共五十八頁,2022年,8月28日一、淋巴細胞類型和數(shù)目的測定1、花結試驗:E花結試驗可用于檢測T細胞數(shù)目。EA花結試驗可用于檢測B細胞數(shù)目。2、免疫熒光法:常采用間接免疫熒光法。3、流式細胞術:借助流式細胞儀(FCM)。第三十五頁,共五十八頁,2022年,8月28日花結試驗示意圖第三十六頁,共五十八頁,2022年,8月28日T細胞功能測定體外法:T細胞增殖試驗形態(tài)學檢查
3H-TdR摻入法
MTT法體內法:用生物抗原或化學抗原作皮內試驗。OT-PPD皮試SD-SK皮試
第三十七頁,共五十八頁,2022年,8月28日培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細胞增殖試驗(3H-TdR摻入法)示意圖第三十八頁,共五十八頁,2022年,8月28日靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細胞毒試驗(51Cr釋放法)示意圖第三十九頁,共五十八頁,2022年,8月28日酶聯(lián)免疫斑點法
(Enzyme-LinkedImmunospot,ELISA)是在ELISA的基礎上建立的檢測抗體生成細胞及細胞因子產生細胞的方法。第四十頁,共五十八頁,2022年,8月28日CK抗體包被的反應板
CK抗原包被的反應板加入淋巴細胞加入酶標記二抗加入底物檢測抗原特異性B細胞加入底物T細胞產生CK的檢測加入淋巴細胞加入酶標的CK抗體第四十一頁,共五十八頁,2022年,8月28日淋巴細胞轉化試驗(形態(tài)學示意圖)原理:人T細胞表面有PHA或ConA受體,T細胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉化為體積較大、代謝旺盛、且能進行分裂的淋巴細胞,以此測定T細胞的功能。
PHA刺激48~72小時第四十二頁,共五十八頁,2022年,8月28日淋巴細胞增殖—3H-TdR摻入法原理:將單個核細胞中加入PHA共同培養(yǎng),在終止培養(yǎng)前8~15小時加入氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),經(jīng)β-液體閃爍儀檢測淋巴細胞DNA的3H-TdR摻入量,推測淋巴細胞增殖的程度。第四十三頁,共五十八頁,2022年,8月28日MTT(四甲基偶氮唑鹽)法原理:在細胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入MTT,活細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶分解MTT產生藍色甲攢(Formazan)沉積于細胞內或細胞周圍,形成甲攢的量與細胞增殖程度成正相關。第四十四頁,共五十八頁,2022年,8月28日細胞毒試驗CTL介導的細胞毒試驗:常采用51Cr釋放法NK細胞的細胞毒試驗:常用的靶細胞為K562細胞第四十五頁,共五十八頁,2022年,8月28日(一)傳統(tǒng)疫苗1、滅活疫苗(死疫苗):是選用免疫原性強的病原微生物,經(jīng)人工大量培養(yǎng)后,用理化方法滅活后制成。常用的死疫苗有乙型腦炎疫苗、狂犬疫苗、霍亂疫苗等。2、減毒活疫苗:用減毒或無毒力的活病原微生物制成的稱為活疫苗,又稱為減毒活疫苗。常用的活疫苗有卡介苗、麻疹疫苗、風疹疫苗、脊髓灰質炎疫苗等。
第四十六頁,共五十八頁,2022年,8月28日2、合成肽疫苗:根據(jù)有效免疫原的氨基酸序列設計合成的免疫原性多肽交聯(lián)載體疫苗。3、結合疫苗將莢膜多糖的水解物連接于白喉類毒素而制備的疫苗。目前已獲準的結合疫苗有流感桿菌、腦膜炎萘瑟菌、肺炎鏈球菌疫苗等。4、重組抗原疫苗是利用DNA重組技術制備的只含保護性抗原的純化疫苗。不含活的病原體及病毒核酸。安全有效,目前獲準生產的有乙肝疫苗、口蹄疫疫苗和萊姆病疫苗。第四十七頁,共五十八頁,2022年,8月28日5、重組載體疫苗:將編碼病原體有效免疫原的基因插入減毒的病毒載體基因中,接種后,隨疫苗株在體內增殖,而表達相應抗原。6、DNA疫苗:用編碼病原體有效免疫原基因的重組體直接接種,在體內可表達保護性抗原,從而誘導機體產生特異性免疫,此為DNA疫苗。7、轉基因植物疫苗:用轉基因方法將編碼有效免疫原的基因導入可食用植物細胞的基因組中,免疫原即可在植物的可食用部分穩(wěn)定表達和積累,人和動物通過攝食達到免疫接種的目的。常用植物有番茄、馬鈴薯、香蕉等。第四十八頁,共五十八頁,2022年,8月28日二、人工被動免疫是給機體輸入抗體,使機體獲得特異性免疫力。輸入抗體后立即獲得免疫力,但維持時間短,一般為2-3周,臨床上主要用于治療或緊急預防。1、抗毒素:
抗毒素主要用于某些細菌外毒素所致疾病的治療和緊急預防。常用的有白喉抗毒素、破傷風抗毒素等。應用時要做皮試,且要早期、足量才能發(fā)揮應有效果。第四十九頁,共五十八頁,2022年,8月28日2、人免疫球蛋白制劑
從正常人血漿或健康產婦胎盤血中提取制成。由于多數(shù)成人已隱性或顯性感染過麻疹、脊髓灰質炎和甲型肝炎等傳染病,血清中含有一定量相應的抗體。因此,這兩種丙種球蛋白可用于上述疾病的治療或緊急預防,有防止發(fā)病、減輕癥狀、縮短病程的效果。還可用于丙種球蛋白缺乏癥的治療。第五十頁,共五十八頁,2022年,8月28日三、計劃免疫
是根據(jù)特定傳染病的疫情監(jiān)測和人群免疫狀況分析,按照規(guī)定的免疫程序有計劃地進行人群預防接種,從而提高人君的免疫水平,達到控制以至最終消滅相應傳染病的目的而采取的重要措施。第五十一頁,共五十八頁,2022年,8月28日
我國推薦的兒童免疫程序年齡疫苗名稱出生時卡介苗、乙型肝炎疫苗11個月乙型肝炎疫苗22個月三價脊髓灰質炎活疫苗13個月三價脊髓灰質炎活疫苗2、百白破14個月三價脊髓灰質炎活疫苗3、百白破25個月百白破36個月乙型肝炎疫苗38個月麻疹疫苗1.5-2歲百白破44歲
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