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普通生物學(xué)實驗(動物、植物)實驗一(1)普通光學(xué)顯微鏡及其使用一、實驗?zāi)康牧私馄胀ü鈱W(xué)顯微鏡的構(gòu)造及其原理,并熟練掌握其操作方法。二、實驗用品普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、濾紙、擦鏡紙。三、實驗原理和方法普通光學(xué)顯微鏡從構(gòu)造上可分光學(xué)、機械和電子三大系統(tǒng)。1、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)通常由物鏡、目鏡、聚光器和光闌組成。1)、物鏡(objective)顯微鏡的質(zhì)量主要取決于物鏡。物鏡種類繁多,性能相差懸殊。物鏡的放大倍數(shù)用數(shù)字表示,如4、10、20、40和100等。a.干燥系(drysystem)物鏡鏡檢時,物鏡與蓋片間,不添加任何液體。如4×、10×、20×和40×物鏡都屬干燥系,使用時不加用任何浸液,只以空氣為介質(zhì),其折射率為1,所以干燥系物鏡的數(shù)值孔徑小,分辨率亦低。b.浸沒系(immersionsystem)物鏡物鏡在使用時,前透鏡與蓋片之間浸滿液體。依充添的浸液的不同,主要可分為油浸系(oilimmersion)和水浸系(waterimmersion)等類別。最常用的浸沒液為香柏油(cederoil),其折射率為1.515,與玻片的折射率相近,且不易干涸。使用水浸物鏡時加用水,其折射率1.33。油浸物鏡外殼上刻有:“oil”、“oel”、“imm”和“HI”等字樣,水浸物鏡刻有“W”或“Water”字樣;油、水浸兩用物鏡則刻上“oil+w”字樣;甘油浸沒物鏡刻有“Glyc”或“Glyz”等字樣。2)、目鏡(eyepiece,ocular)目鏡作為影像和肉眼間的放大鏡,將物鏡映來的影像做第二次放大。同時,目鏡作為物鏡的補償,把物鏡殘留下的像差給予進一步校正,以提高造像質(zhì)量。目鏡作為投影器,把放大的影像投射在攝影暗箱的焦平面上。目鏡通常由兩片(組)正透鏡組成,上面的透鏡叫接目或眼透鏡(eye—lens),它決定倍數(shù)和成像的優(yōu)劣;下面的透鏡叫會聚透鏡(collectivelens)或場鏡(fieldpiece),它使視野邊緣的成像光線向內(nèi)折射,進入眼透鏡中,使物體的影像均勻明亮。上下透鏡的中點,或場鏡下面設(shè)有用金屬制造的光闌叫做視野光闌或場光闌(fieldstop)。場鏡或物鏡在這個光闌面造像,在光闌上可裝入各種目鏡測微計、十字線玻片和指針等。由眼透鏡射出的成像光線基本上為平行光束,并在目鏡之上約10mm處交叉,此交叉點稱作出射光瞳。3)聚光器(condensers)聚光器等聚光系統(tǒng),使來自光源的光線放大,并聚成光束,透過載片照明樣品,射入物鏡。聚光器由聚光鏡和孔徑光闌(aperturediaphragm)構(gòu)成。聚光鏡屬正透鏡系統(tǒng),由一至數(shù)片透鏡組成,具會聚作用,把照明光線會聚放大,射向被檢樣品,進入物鏡??讖焦怅@位于聚光鏡下方,光闌的孔徑可變,以改變照明光束的直徑,調(diào)節(jié)進光量??讖焦怅@的開度,即聚光器數(shù)值孔徑,左右顯微鏡的成像質(zhì)量。物鏡的有效數(shù)值孔徑,其中涵容聚光器的數(shù)值孔徑,即:物鏡的有效數(shù)值孔徑=物鏡數(shù)值孔徑+聚光器數(shù)值孔徑/。2、顯微鏡的照明普通光學(xué)顯微鏡,普遍采用中心亮視野透射照明法。照明光源:照明光源以鎢絲燈和鹵鎢燈為多。鹵鎢燈優(yōu)于鎢絲燈,為顯微鏡的主要光源。3、光路及成像顯微鏡的光路或光程(1ightpath)即光源照明的通路。光路始于光源燈,光源裝在鏡座后方的燈室(1amphousing)內(nèi)。光源燈絲(S)發(fā)出的色光,由聚光透鏡集光成束或光錐,經(jīng)鏡座中的視場光闌(L),投向反光鏡,呈現(xiàn)45°折射向上,入射孔徑光闌,光源燈絲在此平面處第一次成像(S1)。透過聚光鏡使光線放大、聚集,透射、照明載物臺的樣品,視場光闌在此平面處第一次成像(L1),即在樣品聚焦的同時,可見清晰的、縮小的視場光闌的影像。成像光束繼而進入物鏡,在物鏡的后焦面(rearfocalplane)的平面處,光源燈絲第二次成像(S2)。成像光束經(jīng)轉(zhuǎn)折進入目鏡,在目鏡的場光闌平面處,視場光闌第二次成像(L2)。最終,成像光束從目鏡眼透鏡射出,在目鏡的出射光瞳處,光源燈絲第三次成像(S3)。視場光闌的第三次成像(L3)在人眼的視網(wǎng)膜上。在成像系統(tǒng)中,一個位置的改變,會引起整個成像關(guān)系的改變,光源燈前后位置的稍許位移將導(dǎo)致光源成像位置的變動。4、放大率(magnification)顯微鏡最后形成的物體放大影像,對被檢物體的大小比例稱為放大率,即像高比物高。放大倍數(shù)以長度計算,而不是以面積或體積計算。某些顯微鏡為適應(yīng)不同需要,鏡筒內(nèi)裝有倍數(shù)不同的附加透鏡系統(tǒng)。在專用的顯微攝影裝置中,附有攝影透鏡(photographiclens)。顯微攝影總放大率的計算,除目鏡、物鏡的放大率外,攝影透鏡的放大率亦要計算在內(nèi)。顯微鏡的總放大率(Mt)應(yīng)為;Mt=Mob×Me×MphMob:物鏡放大率Me:目鏡放大率Mph:攝影透鏡放大率5、顯微鏡的使用正確、合理地使用顯微鏡,是做好鏡檢和顯微攝影的前提。1)光路合軸調(diào)整照明光束應(yīng)與顯微鏡的光軸合一,使光源均勻地照明視場。鏡檢和攝影前,光路要合軸調(diào)整,使照明光束與顯微鏡的光軸于同一軸線上。光路系統(tǒng)中的目鏡、物鏡和視場光闌位置固定,勿需調(diào)整,僅聚光器可調(diào)。因此,光路的合軸實為聚光器和光源燈的調(diào)中。a.聚光器的調(diào)中聚光器的調(diào)中步驟如下:(1)轉(zhuǎn)動聚光器升降旋鈕,把聚光器升至最高位置。(2)接通光源燈的電源開關(guān)。(3)將制片標本放在載物臺上,用4X或低倍物鏡對樣品聚焦。(4)縮小視場光闌,在視場中可見邊緣模糊的視場光闌圖像。(5)微降聚光器,至視場光闌的圖像清晰聚焦止。(6)用聚光器兩個調(diào)中的螺桿推動聚光器,使縮小的視場光闌的圖像,調(diào)至視場中心。(7)開放視場光闌,使多角形的周邊與視場邊緣相接。(8)反復(fù)縮放視場光闌,確認光闌中心和邊緣與視場完全重合。(9)使聚光器回復(fù)頂點位置。在視場中,通過觀察視場光闌影像的相對移動,使聚光器調(diào)中,達到光軸合一。2)光闌及其使用顯微鏡有兩種光闌:視場光闌和孔徑光闌。視場光闌控制照明光束,限定視場大小??讖焦怅@通過光闌的放縮,限定,聚光鏡的孔徑大小。兩者皆為可變光闌(irisdiaphragm),正確調(diào)節(jié)和使用光闌,是保證鏡檢和攝影質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。四、思考題1.物鏡的種類各具何種特點?2.目鏡在顯微鏡的成像上起何作用?3.聚光器的構(gòu)成及其作用?4.如何進行光路合軸調(diào)節(jié)?5.物鏡和目鏡的選用及其組合的原則?實驗一(2)細胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)一、實驗?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)并掌握顯微鏡的正確使用方法。了解真核細胞的各種形態(tài)和基本結(jié)構(gòu)。學(xué)習(xí)臨時裝片標本的制作方法。了解植物細胞中貯藏的內(nèi)含物種類及其特性。二、實驗原理細胞是構(gòu)成植物體的基本單位,也是植物生命活動的基本單位。根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和生命活動的方式,可以把構(gòu)成生物有機體的細胞分為兩類,即原核細胞和真核細胞。原核細胞內(nèi)沒有典型的細胞核,也沒有分化出以膜為基礎(chǔ)的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的細胞器;而真核細胞的DNA主要集中在由核膜包被的細胞核中,并分化出多種以膜為基礎(chǔ)的細胞器。高等植物核絕大多數(shù)低等植物均由真核細胞構(gòu)成。植物細胞通常很小,其直徑一般在20~50μm之間,因而要借助顯微鏡才能觀察到。但也有少數(shù)植物細胞,如苧麻(Boehmerianivea)的纖維細胞長可達550mm,用肉眼即可看到。盡管不同植物細胞在形態(tài)、大小上有一定差異,但它們的基本結(jié)構(gòu)是一致的。三、實驗材料和用品實驗材料:1、洋蔥鮮鱗莖。2、新鮮菠菜。3、馬鈴薯塊莖。4、新鮮花生米或菜豆種子。實驗器材:顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀、吸管、尖頭鑷子、刀片等實驗試劑:1、碘-碘化鉀溶液:取3g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中,再加入1g碘,溶解后即可使用。此液應(yīng)放在棕色試劑瓶中,暗處保存。2、蘇丹=3\*ROMANIII染液:、先將0.1g蘇丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中,再加入70%酒精50ml。四、實驗內(nèi)容1、以洋蔥鱗莖的表皮為材料,在光鏡下觀察植物細胞的基本組成和結(jié)構(gòu)。2、菠菜葉肉細胞中葉綠體的觀察。3、蠶豆表皮細胞氣孔的觀察。4、運用特異性染色方法鑒定植物細胞中主要的內(nèi)含物。五、實驗方法和步驟1、物細胞結(jié)構(gòu)的觀察1)洋蔥鱗片葉表皮細胞臨時裝片標本的制作與觀察取一洗凈的載玻片,用紗布擦干,于玻片中央滴一滴蒸餾水,用尖頭鑷子從洋蔥肉質(zhì)鱗片葉內(nèi)表皮撕下一小塊表皮,鋪在水滴上,用解剖針輕輕將其壓入水中,使之展平。用鑷子夾住洗凈擦干的蓋玻片的一邊,使另一邊接觸水滴的邊緣,然后慢慢地放下,以便驅(qū)走蓋玻片下的空氣,不致產(chǎn)生氣泡。用吸水紙吸去蓋玻片周圍的水,于顯微鏡下觀察。在低倍下,可見洋蔥表皮細胞略呈長方形,排列緊密,每個細胞內(nèi)有一圓形或扁圓形的細胞核。在蓋玻片的一側(cè)滴上一滴碘-碘化鉀溶液,滴在蓋玻片邊緣的載玻片上,然后用吸水紙一側(cè)將蓋玻片下的水分吸去,把染料引入蓋玻片與載玻片之間,對材料進行染色觀察。注意:1.撕表皮時不要把表皮撕得過大,如撕下的表皮面積大于蓋玻片,要將表皮放在有水的載玻片上,用刀片切成小塊,便于觀察。2.撕表皮時動作要迅速,勿將撕下的表皮在空氣中暴露時間過久,以免使生活細胞由于失水而受到損傷。3.撕開的一面最好朝上放在載玻片上,以利于染色和進行組織化學(xué)實驗的觀察。4.撕下的表皮一定要平鋪在有水的載玻片上,如發(fā)生褶皺或重疊要用解剖針將其鋪平,以免影響觀察效果。2).菠菜葉肉細胞葉綠體的觀察取一新鮮菠菜葉片,用鑷子撕去一小塊下表皮,用小刀輕輕刮取一點葉肉細胞,制作菠菜葉肉細胞臨時裝片標本。將所制標本先置低倍鏡下觀察,然后再轉(zhuǎn)高倍鏡,注意葉肉細胞內(nèi)葉綠體的形態(tài)、數(shù)目。3).氣孔的觀察取新鮮蠶豆葉片,用刀片在葉的背面輕輕劃一個小方塊,用鑷子從切口處夾住表皮,并向切開的方向撕下表皮,放在載玻片上的水滴中,用鑷子展平,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察,先在低倍鏡下找出比較薄的部位,然后換至高倍鏡下觀察。注意觀察氣孔的形態(tài)及類型。4).植物細胞的內(nèi)含物在細胞代謝活動中,常常有一些代謝產(chǎn)物以不同形式貯存在液泡、細胞質(zhì)或細胞器中,其中有些物質(zhì),如淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等可以通過特殊的顯色方法顯示出來。取馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖切成兩半,用解剖刀在切開的塊莖表面輕輕刮一下,將附著在刀口附近的渾濁汁液放在載玻片上,用碘-碘化鉀染色,然后蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察。取一粒菜豆(Phaweolusvulgaris)種子,剝?nèi)シN皮,用刀片對含有豐富貯藏物質(zhì)的肥厚子葉做徒手切片,選取較薄的切片放在載玻片上,用碘-碘化鉀染色,蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察。其中被染成金黃色的顆粒是糊粉粒,這是蛋白質(zhì)的一種貯藏形式。取花生(Arachishypogaea)種子,做徒手切片,選取較薄的切片放在載玻片上,用蘇丹=3\*ROMANIII染色,然后蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞內(nèi)的脂肪被染成紅色。六、實驗報告繪制洋蔥表皮細胞及細胞核。繪圖表示菠菜葉綠體的形態(tài)。繪制蠶豆表皮的氣孔。制造臨時裝片應(yīng)該注意些什么問題?附植物科學(xué)繪圖基本方法植物繪圖是通過繪圖的方式,來表現(xiàn)植物的一些重要形態(tài)解剖特征的常用方法。通過繪圖,有助于對植物結(jié)構(gòu)及其特征的認識和理解,是學(xué)習(xí)植物生物學(xué)必須掌握的技能,也是從事植物形態(tài)解剖以及分類學(xué)研究必備的常用技能之一。一、繪圖的基本要求為保證所繪制的植物圖示的形象與科學(xué),應(yīng)該注意以下幾點:=1\*GB2⑴科學(xué)性和準確性繪植物圖不同于一般的美術(shù)創(chuàng)作,它必須具有高度的科學(xué)性和準確性。這就要求我們必須認真觀察要畫的對象(切片或標本等),學(xué)習(xí)與之有關(guān)的文字記載及描述,正確理解了各部分的特征,然后還要選出正常的典型材料,才能在繪圖時保證形態(tài)結(jié)構(gòu)的準確性。=2\*GB2⑵點、線要清晰流暢線條要一筆畫出,粗細均勻、光滑清晰,接頭處無分叉和重線條痕跡,切忌重復(fù)描繪。植物圖一般用圓點襯陰,表示明暗和顏色的深淺,給予立體感。點要圓而整齊,大小均勻,根據(jù)需要靈活掌握疏密變化,不能用涂抹陰影的方法代替圓點。=3\*GB2⑶比例要正確繪圖是要安植物各器官、組織以及細胞等各部構(gòu)造原有比例繪出,繪放大的解剖圖或形態(tài)圖時,最好要注明放大的倍數(shù),如15×40等,也可以用單位短線表示出長度,如“└┘1cm”等(倍數(shù)一般以長度的比例為準)。=4\*GB2⑷突出主要特征植物學(xué)繪圖中允許重點描繪植物的主要形態(tài)特征,而其他部分可僅繪出輪廓,以表示其完整性。=5\*GB2⑸圖紙及版面要保持整潔繪圖完成后,圖紙及版面要整潔清晰。=6\*GB2⑹準確的標注圖注一律用正楷書寫,應(yīng)盡量詳細,并要求用水平的直線引出,最好在圖的右側(cè),必須整齊一致。作為實驗報告,圖及圖注一律要求用鉛筆,通常用2H或3H鉛筆,不要用鋼筆、有色水筆或圓珠筆。實驗題目寫在繪圖報告紙的上方,圖題和所用植物材料的名稱和部位寫在圖的下方。二、繪圖的一般步驟繪制植物圖常常要運用多種測量、描繪的儀器用具,以達到描繪精確的目的。但對一個普通的植物學(xué)工作者或研究人員,只需要掌握最簡單的繪圖技能,即用鉛筆直接繪圖。應(yīng)遵循以下步驟:=1\*GB2⑴構(gòu)圖根據(jù)所要表達植物材料的內(nèi)容要求,設(shè)計好所要繪制的各個部分各自所占位置,避免因畫面設(shè)計不合理造成排列的混亂與失衡,影響繪圖的質(zhì)量。=2\*GB2⑵先繪草圖再繪成圖用尖的軟鉛筆(HB)輕輕地在圖紙上勾畫出圖形輪廓的草圖,以便于修改。勾畫時,要注意對照觀察所畫輪廓大小是否與實物相符合。正式繪制時要用2H或3H的繪圖硬鉛筆,按順手的方向動筆,描出與物體相吻合的線條。線條要均勻,最好一次成圖,不繪重線,以免模糊。=3\*GB2⑶概繪全圖細繪局部在繪植物的宏觀解剖圖時要先繪全形圖,后繪部分的解剖圖。邊解剖觀察,邊描繪作圖,嚴格地按一定次序解剖繪圖。因材料放置的時間越短,特征就越明顯,越不易遺漏。如繪花的外形圖后,取出各花瓣一次擺在玻璃板上,一一繪出;然后繪雄蕊與雌蕊的子房、花柱及柱頭等。注意:繪輪廓時可采用各種輔助方法。如比例尺、坐標紙及實物測量等。如果繪的圖是要出版或發(fā)表的,則還需要用繪圖筆細致地描在硫酸紙上,或直接用電腦繪圖。實驗二(1)
坐骨神經(jīng)—腓腸肌標本制備【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)動物學(xué)實驗基本的組織分離技術(shù);學(xué)習(xí)和掌握制備蛙類坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本的方法;掌握刺激的種類及形式?!緦嶒瀸ο蟆矿蛤芑蛲堋緦嶒炂鞑摹科胀舻?、手術(shù)剪、眼科鑷(或尖頭無齒鑷)、金屬探針(解剖針)、玻璃分針、蛙板(或玻璃板)、蛙釘、細線、培養(yǎng)皿、滴管、鋅銅弓(或電子刺激器)、任氏液、食鹽、1%H2SO4濾紙?!緦嶒灧椒ㄅc步驟】本次實驗首先由教師示教,然后同學(xué)三人一組(手術(shù)者一人、助手兩人)各任不同的手術(shù)職責(zé)進行手術(shù)。破壞腦、脊髓取蟾蜍一只,用自來水沖洗干凈(勿用手搓)。左手握住蟾蜍,使其背部向上,用大拇指或食指使頭前俯(以頭顱后緣稍稍拱起為宜)。右手持探針由頭顱后緣的枕骨大孔處垂直刺入椎管(圖1-1)。然后將探針改向前刺入顱腔內(nèi),左右攪動探針2~3次,搗毀腦組織。如果探針在顱腔內(nèi),應(yīng)有碰及顱底骨圖1-1搗毀蟾蜍脊髓的感覺。再將探針退回至枕骨大孔,使針尖轉(zhuǎn)向尾端,捻動探針使其刺入椎管,搗毀脊髓。此時應(yīng)注意將脊柱保持平直。針進入椎管的感覺是,進針時有一定的阻力,而且隨著進針蟾蜍出現(xiàn)下肢僵直或尿失禁現(xiàn)象。若腦和脊髓破壞完全,蟾蜍下頜呼吸運動消失,四肢完全松軟,失去一切反射活動。此時可將探針反向捻動,退出椎管。如蟾蜍仍有反射活動,表示腦和脊髓破壞不徹底,應(yīng)重新破壞。剪除軀干上部、皮膚及內(nèi)臟
用左手捏住蟾蜍的脊柱,右手持粗剪刀在前肢腋窩處連同皮膚、腹肌、脊柱一并剪斷(圖1-2),然后左手握住蟾蜍的后肢,緊靠脊柱兩側(cè)將腹壁及內(nèi)臟剪去(注意避開坐骨神經(jīng)),并剪去肛門周圍的皮膚,留下脊柱和后肢(圖1-3)。圖1-2橫斷脊柱圖1-3剪除軀干上部及內(nèi)臟剝皮
一只手捏住脊柱的斷端(注意不要捏住脊柱兩側(cè)的神經(jīng)),另一只手捏住其皮膚的邊緣,向下剝?nèi)ト亢笾钠つw(圖1-4)。將標本放在干凈的任氏液中。將手及使用過的探針、剪刀全部沖洗干凈。圖1-4剝?nèi)テつw分離兩腿
用鑷子取出標本,左手捏住脊柱斷端,使標本背面朝上,右手用粗剪刀剪去突出的骶骨(也可不進行此步)。然后將脊柱腹側(cè)向上,左手的兩個手指捏住脊柱斷端的橫突,另一手指將兩后肢擔(dān)起,形成一個平面。此時用粗剪刀沿正中線將脊柱盆骨分為兩半(注意勿傷坐骨神經(jīng))。將其中一半后肢標本置于盛有任氏液中備用,另一半放在蛙板上進行下列操作。辯認蛙后肢的主要肌肉蛙類的坐骨神經(jīng)是由第7、8、9對脊神經(jīng)從相對應(yīng)的椎間孔穿出匯合而成,行走于脊柱的兩側(cè),到尾端(肛門處)繞過坐骨聯(lián)合,到達后肢背側(cè),行走于梨狀肌下的股二頭肌和半膜肌之間的坐骨神經(jīng)溝內(nèi),到達膝關(guān)節(jié)腘窩處有分支進入腓腸肌。游離坐骨神經(jīng)和腓腸肌用蛙釘或左手的兩個手指將標本繃直、固定。先在腹腔面用玻璃分針沿脊柱游離坐骨神經(jīng),然后在標本的背側(cè)于股二頭肌與半膜肌的肌肉縫內(nèi)將坐骨神經(jīng)與周邊的結(jié)締組織分離直到腘窩,但不要傷及神經(jīng),其分支待以后用手術(shù)剪剪斷。同樣用玻璃分針將腓腸肌與其下的結(jié)締組織分離并在其跟腱處穿線、結(jié)扎。剪去其它不用的組織操作應(yīng)從脊柱向小腿方向進行。剪去多余的脊柱和肌肉
將后肢標本腹面向上,將坐骨神經(jīng)連同2~3節(jié)脊椎用粗剪刀從脊柱上剪下來。再將標本背面向上,用鑷子輕輕提起脊椎,自上而下剪去支配腓腸肌以外的神經(jīng)分支,直至腘窩(圖1-5A),并搭放在腓腸肌上。沿膝關(guān)節(jié)剪去股骨周圍的肌肉,并將股骨刮凈,用粗剪刀剪去股骨上端的1/3(保留2/3),制成坐骨神經(jīng)-小腿的標本。完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標本
將脊椎和坐骨神經(jīng)從腓腸肌上取下,提起腓腸肌的結(jié)扎線剪斷跟腱。用粗剪剪去膝關(guān)節(jié)以下部位,便制成了坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本(圖1-5B)。檢驗標本
用沾有任氏液的鋅銅弓觸及一下(或電刺激刺激)坐骨神經(jīng)或用鑷子夾持坐骨神經(jīng)中樞端,如腓腸肌發(fā)生迅速而明顯的收縮,說明標本的興奮性良好。標本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中備用。然后再依次用熱玻棒、食鹽(或1%H2SO4濾紙)刺激坐骨神經(jīng)中樞端(或肌肉),觀察肌肉收縮有何變化。如果放上食鹽肌肉無動靜,用任氏液將鹽沖洗掉,再觀察沖洗過程中肌肉收縮有何變化。圖1-5分離坐骨神經(jīng)(A)和坐骨神經(jīng)腓腸標本(B)【注意事項】避免蟾蜍體表毒液和血液污染標本,不可壓擠、損傷和用力牽拉標本,不可用金屬器械觸碰神經(jīng)干。在操作過程中,應(yīng)給神經(jīng)和肌肉滴加任氏液,防止表面干燥,以免影響標本的興奮性。標本制成后須放在任氏液中浸泡數(shù)分鐘,使標本興奮性穩(wěn)定,再開始實驗效果會較好。熱玻棒的溫度應(yīng)防止過高,以免燙傷標本。實驗二(2)蛙離體心臟灌流標本的制備【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)蛙離體心臟灌流標本的制備方法。【實驗對象】蛙【實驗器材】蛙類常用手術(shù)器械一套、玻璃分針、蛙板、蛙釘、蛙心插管、蛙心夾、試管夾、滴管燒杯、雙凹夾、萬能支架、細線、任氏液?!緦嶒灧椒ㄅc步驟】本次實驗首先由教師示教,然后同學(xué)三人一組(手術(shù)者一人、助手兩人)各任不同的手術(shù)職責(zé)進行手術(shù)。圖2-1插管進入心室示意圖離體蛙心灌流標本制備(斯氏蛙心插管法):取蟾蜍一只,打開胸腔,暴露心臟。在主動脈干下方穿雙線,一條在左主動脈上端結(jié)扎作插管時牽引用;另一根在動脈球上方打一活結(jié)備用(用以結(jié)扎和固定插管)。玻璃分針將心臟向前翻轉(zhuǎn),在心臟背側(cè)找到靜脈竇,在靜脈竇以外的地方做一結(jié)扎(切忽扎住靜脈竇),以阻止血液繼續(xù)回流心臟(也可不進行此操作)。左手提起左主動脈上方的結(jié)扎線,右手持眼科剪在左主動脈根部(動脈球前端)沿向心方向剪一斜口,將盛有少許任氏液、大小適宜的蛙心插管由此開口處輕輕插入動脈球。當(dāng)插管尖端到達動脈球基部時,應(yīng)將插管稍向后退(因主動脈內(nèi)有螺旋瓣會阻礙插管前進),并將插管尾端稍向右主動脈方向及腹側(cè)面傾斜,使插管尖端向動脈球的背部后方及心尖方向推進,在心室收縮時經(jīng)主動脈瓣進入心室(見圖2-1)。注意插管不可插得過深,插管的斜面應(yīng)朝向心室腔,以免插管下口被心室壁堵住。若插管中任氏液面隨心室的收縮而上下波動,則表明插管進入心室,可將動脈球上已準備好的松結(jié)扎緊,并固定于插管側(cè)面的鉤上,以免蛙心插管滑出心室。剪斷結(jié)扎線上方的血管,輕輕提起插管和心臟,在左右肺靜脈和前后腔靜脈下引一細線并結(jié)扎(參考圖2-1),于結(jié)扎線外側(cè)剪去所有相連的組織則得到離體蛙心。此步操作中應(yīng)注意靜脈竇不受損傷并與心臟連結(jié)良好。最后,用任氏液反復(fù)換洗插管內(nèi)的任氏液,直到插管中無殘留血液為止。此時,離體蛙心標本制備成功,可供實驗?!咀⒁馐马棥恐苽潆x體心臟標本時,勿傷及靜脈竇。蛙心夾應(yīng)在心室舒張期一次性夾住心尖,避免因夾傷心臟而導(dǎo)致漏液。實驗三植物細胞死活的鑒定和組織滲透勢的測定一、實驗?zāi)康睦觅|(zhì)壁分離現(xiàn)象驗證植物細胞的死活及測定植物組織的滲透勢;理解植物組織水勢的組成及發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象的條件。二、實驗原理植物活細胞是一個滲透系統(tǒng),當(dāng)其處于高滲溶液中時,細胞失水,原生質(zhì)體體積縮小,發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象。若將發(fā)生質(zhì)壁分離的細胞轉(zhuǎn)移至低滲溶液中,細胞會重新吸水,原生質(zhì)體膨脹,質(zhì)壁分離復(fù)原。由于死細胞的質(zhì)膜失去半滲透性,不能發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原現(xiàn)象。因此質(zhì)壁分離法可用于鑒定植物細胞的死活。利用植物活細胞的質(zhì)壁分離及其復(fù)原現(xiàn)象,可測定植物組織的滲透勢。當(dāng)植物細胞或組織放在外界等滲溶液中時,組織與外界溶液的水分交換達到動態(tài)平衡,植物細胞處于初始質(zhì)壁分離狀態(tài),細胞壓力勢為零,溶液的滲透勢即等于所測植物的滲透勢(壓力勢為零的水勢)。用一系列梯度濃度溶液浸泡組織,并觀察細胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象。能引起植物組織細胞發(fā)生初始質(zhì)壁分離的溶液濃度或介于發(fā)生質(zhì)壁分離的溶液和相鄰沒有發(fā)生質(zhì)壁分離的溶液之間的濃度,即為等滲濃度。根據(jù)公式計算植物組織的滲透勢。三、實驗器材和試劑1、植物材料洋蔥鱗莖或蠶豆葉2、實驗器材顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、解剖針、刀片、酒精燈、濾紙、滴管、移液管、9cm培養(yǎng)皿3.實驗試劑1mol/L蔗糖溶液四、實驗步驟1、質(zhì)壁分離及其復(fù)原現(xiàn)象觀察1).撕取一小塊洋蔥鱗片的內(nèi)表皮,放在滴有1~2滴蒸餾水的載玻片,蓋上蓋玻片。顯微鏡下觀察植物細胞的狀態(tài),并繪圖表示之。2).在蓋玻片的一端滴加2~3滴1mol/L的蔗糖溶液,同時在另一端用濾紙吸去水分,使植物材料浸入蔗糖溶液中,在顯微鏡下連續(xù)觀察細胞有何變化,解釋變化原因,并繪圖表示細胞此時的狀態(tài)。3).按照上述步驟,在蓋玻片的一端滴加蒸餾水,使材料重新浸入蒸餾水中,觀察細胞的變化,并解釋變化原因。4).另取洋蔥鱗片內(nèi)表皮一小塊,放在有數(shù)滴蒸餾水的載玻片上,酒精燈上小心加熱2~3min(或用酒精浸泡)將植物細胞殺死,冷卻后在載玻片上滴加1mol/L蔗糖液,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察植物細胞是否有質(zhì)壁分離現(xiàn)象出現(xiàn),并解釋原因。2、植物組織滲透勢的測定1).配制0.1~0.8mol/L8個梯度的蔗糖溶液各10ml,分別盛于小培養(yǎng)皿中,并加上蓋子。2).從部位相近的鱗片撕取大小相近(約幾個平方毫米)的內(nèi)表皮,從濃度高的蔗糖溶液開始,依次每隔3min投放內(nèi)表皮到一種濃度的溶液中(以便有充足的時間觀察,并使組織在不同溶液中處理時間一致),并使之完全浸沒,室溫下放置30min。3).按濃度由高到低依次取出處理過的表皮,放在有1~2相應(yīng)濃度蔗糖溶液的載玻片,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察觀察質(zhì)壁分離的情況(每次鏡檢約100個細胞),并記錄不同濃度溶液處理下質(zhì)壁分離的程度。4).依據(jù)不同溶液中植物細胞質(zhì)壁分離的程度,確定一個引起50%的細胞角隅上出現(xiàn)質(zhì)壁分離(作為初始質(zhì)壁分離)的溶液濃度,或確定引起細胞質(zhì)壁分離最低濃度下不引起質(zhì)壁分離最高濃度的平均值,作為等滲濃度。用新的溶液和植物材料進行重復(fù)實驗過程,以確保結(jié)果的準確性。5).依據(jù)所確定的等滲濃度,根據(jù)下式計算該植物組織的平均滲透勢。計算公式:平均滲透勢=解離系數(shù)i×氣體常數(shù)×絕對溫度T×等滲濃度c。平均滲透勢φs,以bar表示;蔗糖解離系數(shù)i為1;氣體常數(shù)R為0.083L.bar/mol.k;絕對溫度T=273℃等滲濃度c,mol/L。五、實驗報告1、計算實驗中測得的植物組織水勢2、不同濃度的NaCl可否用于測定植物組織的滲透勢?實驗四兔的麻醉及局部解剖【實驗?zāi)康摹空莆談游锫樽淼姆椒?;掌握解剖哺乳動物的基本技術(shù);掌握手術(shù)器械的使用方法;掌握組織切開、止血等基本操作技術(shù)?!緦嶒瀸ο蟆考彝谩緦嶒炂鞑摹坎溉轭悇游锸中g(shù)器械一套(包括手術(shù)刀、粗剪、手術(shù)剪、眼科剪、止血鉗、鑷子等)、兔手術(shù)臺、注射器、20%氨基甲酸乙酯溶液、1000U/ml肝素溶液?!緦嶒灧椒ㄅc步驟】本次實驗首先由教師示教,然后同學(xué)三人一組(手術(shù)者一人、助手兩人)各任不同的手術(shù)職責(zé)進行手術(shù)。動物的麻醉將家兔稱重,按5ml/kg的劑量于耳緣靜脈注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉。然后將家兔背位(仰臥)固定于兔手術(shù)臺上。局部解剖在進行局部解剖之前,先觀察兔子的大體外形,區(qū)分頭、頸、軀干、尾和四肢五部分。頸部神經(jīng)、血管和氣管的暴露與分離
兔的頸部神經(jīng)、血管、氣管的解剖位置關(guān)系清晰、分支較少。更為突出的是,兔的減(降)壓神經(jīng)單獨為一支,與迷走神經(jīng)、交感神經(jīng)、頸動脈伴行(圖3-1),是進行心血管活動及內(nèi)臟神經(jīng)功能研究的理想的實驗材料。圖3-1家兔的頸部分離①分離氣管剪去頸前部兔毛,用手術(shù)刀在喉頭下緣沿頸前正中線做一5~7cm長的切口,用止血鉗縱向分離皮下組織,于正中線分開頸部的胸骨舌骨肌和胸鎖乳突肌,暴露氣管。用玻璃分針或手術(shù)刀柄將覆蓋在氣管表面的筋膜除去,使氣管完全暴露。用彎頭止血鉗或鑷子在氣管下穿一根線備用。②分離頸總動脈位于氣管兩側(cè),分離覆蓋在氣管上的胸骨舌骨肌和側(cè)面斜行的胸鎖乳突肌,深處可看到頸動脈鞘。分離時,可用左手拇指和食指捏住已分離的氣管一側(cè)的胸骨舌骨肌,再稍向外翻,即可將頸總動脈以及神經(jīng)束翻于食指上。用玻璃解剖針或止血鉗輕輕分離動脈外側(cè)的結(jié)締組織,仔細分離鞘膜即可看到搏動的頸總動脈,在其下穿線備用。③神經(jīng)
于頸總動脈旁有一束神經(jīng)與其伴行。小心分離頸總動脈的鞘膜后仔細辯認該神經(jīng)束中的三條神經(jīng):其中最粗的是迷走神經(jīng),最細的是減(降)壓神經(jīng),交感神經(jīng)粗細介于二者之間。在頸部中央段,迷走神經(jīng)位于最外側(cè),減(降)壓神經(jīng)靠近頸總動脈,交感神經(jīng)位于二者之間。減(降)壓神經(jīng)細如毛發(fā),常與交感神經(jīng)緊貼在一起。用玻璃分針將所需要的神經(jīng)分離出1~2cm,穿線備用。氣管插管
在暴露的氣管上用手術(shù)剪于喉頭下2~3cm處的兩軟骨環(huán)之間,橫向切開氣管前壁約1/3的氣管直徑,再于切口上緣向頭側(cè)剪開約0.5cm長的縱向切口,整個切口呈“⊥”
。若氣管內(nèi)有分泌物或血液要用小干棉球拭凈。然后一手提起氣管下面的縛線,一手將一適當(dāng)口徑的“Y”氣管插管斜口朝下,由切口向下插入氣管腔內(nèi),再轉(zhuǎn)動插管使其斜口面朝上,用線縛結(jié)于套管的分叉處,加以固定(圖3-2)。圖3-2氣管插管示意圖【注意事項】麻醉劑劑量不能過量,注射不宜過快。神經(jīng)、肌肉和血管都是比較嬌嫩的組織,在分離過程中要仔細、耐心、輕柔。分離時應(yīng)掌握先神經(jīng),后血管;先細后粗的原則。分離的方向一般要求與神經(jīng)、血管的走向平行,才能避免損傷組織。實驗五植物體內(nèi)幾種呼吸酶的鑒定一、實驗原理植物的呼吸其實質(zhì)是在植物體內(nèi)進行的一系列酶促氧化還原反應(yīng)。本實驗包括鑒定幾種呼吸酶的方法。這些呼吸酶中有的參加線粒體呼吸,有的存在于細胞質(zhì)中,不參加線粒體呼吸。這些酶鑒定原理如下:1.脫氫酶以亞甲藍作氫受體。氧化態(tài)的亞甲藍,接受底物脫下的氫而還原為無色的還原態(tài)亞甲藍。2.細胞色素氧化酶在植物體內(nèi),細胞色素氧化酶能催化細胞色素c的氧化。通常利用該酶能催化二甲基對苯二胺和α—萘酚作用,生成藍色物質(zhì)的反應(yīng)來鑒定該酶的存在。3.多酚氧化酶該酶催化酚及其類似化合物被分子態(tài)氧氧化為醌類化合物的反應(yīng)。氧化態(tài)的醌可自動氧化成棕黑色的化合物。本實驗用鄰苯二酚為底物檢驗多酚氧化酶的存在。4.過氧化物酶該酶以H2O2為氧化劑,催化H2O2氧化另一種底物。本實驗以聯(lián)苯胺為供氫體,反應(yīng)后生成藍色物質(zhì)。5.過氧化氫酶該酶催化H2O2分解成水和氧,O2的產(chǎn)生標志著該酶的存在。二、實驗材料和設(shè)備1、植物材料:用水浸泡24h的豌豆種子;馬鈴薯塊莖。2、設(shè)備:試管及試管架;;燒杯;漏斗;量筒;恒溫水浴鍋;解剖刀;吸量管。3、試劑:0.01%甲烯藍溶液;pH7.0的磷酸緩沖液(0.2mol配法:NaH2.H2O10.7g/lNaH2.2H2O12.17g/lNa2H.2H2O21.71g/lNa2H.12H2O43.70g/l1%鄰苯二酚乙醇溶液1%α-萘酚乙醇溶液1%鹽酸二甲基-對-苯二胺溶液(冰箱貯存,一周內(nèi)使用)1%聯(lián)苯胺乙醇溶液3%H2O2。三、實驗步驟1、脫氫酶取10g用水浸泡24h的豌豆種子,剝?nèi)シN皮,分開兩片子葉,分別放入兩支試管內(nèi)。向其中1支試管內(nèi)加入少量蒸餾水,在沸水浴中加熱5min,倒出水。然后,分別向兩支試管中加入5ml甲烯藍溶液,染色10min。染色結(jié)束后,倒出甲烯藍溶液,用水沖洗,此的種子表面應(yīng)呈藍色。然后加水至接近管口,將試管放入37℃將表面藍色消失的種子倒出,暴露于空氣中,現(xiàn)察種子表面的變化,并解釋之。2、細胞色素氧化酶、多酚氧化酶和過氧化物酶1).酶液的制備取l0g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖,切碎,放入研缽中,加少量磷酸緩沖液,低溫下研磨成勻漿。用緩沖液將勻漿洗入小燒杯中,加磷酸緩沖液至25ml,在冰浴中浸提20min,用脫脂棉過濾。收集濾液15ml,分成兩份,一份于沸水浴中煮5min,另一份置于冰浴中。2).酶的鑒定取6支試管分成兩組,依次編號為l、2、3。向其中一組試管內(nèi)加入煮過的酶液各2ml;向另一組試管內(nèi)加入置于冰浴中的酶液各2ml。然后向1號試管內(nèi)加入1ml二甲基-對-苯二胺和1mlα-萘酚,向2號試管內(nèi)加入2ml鄰苯二酚;向3號試管內(nèi)加入1ml聯(lián)苯胺和1mlH2O2。將試管內(nèi)的底物與酶液混勻,于37℃3、過氧化氫酶將馬鈴薯塊莖切成約5mm3的小塊。取兩支試管,每支放入3塊馬鈴薯小塊。其個1支加入少量的水,將薯塊浸沒,于沸水浴中加熱5min,然后將水倒出。分別向兩支試管內(nèi)加入5ml3%H2O2,觀察兩種馬鈴薯小塊周圍有無氣泡產(chǎn)生。四、實驗報告將所鑒定的5種呼吸酶、底物(分成氧化劑和還原劑兩類)和反應(yīng)的結(jié)果列表表示。酶的名稱底物實驗結(jié)果加熱不加熱注意:1:檢測過氧化物酶時,當(dāng)樣品顯出籃色時,應(yīng)立即取出觀察,否則藍色會轉(zhuǎn)變成棕色復(fù)合物,影響實驗結(jié)果。實驗六兔頸部動脈、輸尿管插管【實驗?zāi)康摹空莆胀妙i部動脈、輸尿管插管的方法【實驗對象】家兔【實驗器材】哺乳類動物手術(shù)器械一套(包括手術(shù)刀、粗剪、手術(shù)剪、眼科剪、止血鉗、鑷子等)、兔手術(shù)臺、動脈夾、動脈套管、注射器、20%氨基甲酸乙酯溶液、1000U/ml肝素溶液。【實驗方法與步驟】本次實驗首先由教師示教,然后同學(xué)三人一組(手術(shù)者一人、助手兩人)各任不同的手術(shù)職責(zé)進行手術(shù)。動物的麻醉將家兔稱重,按5ml/kg的劑量于耳緣靜脈注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉。然后將家兔背位(仰臥)固定于兔手術(shù)臺上。頸動脈插管
頸部剪毛,沿頸部正中線切開皮膚5~7cm,用止血鉗鈍性分離皮下組織及淺層肌肉,暴露和分離氣管。分離左、右兩側(cè)頸總動脈。事先準備好插管導(dǎo)管,取適當(dāng)長度的塑料管或硅膠管,插入端剪一斜面,另一端連接于裝有抗凝溶液(或生理鹽水)的血壓換能器或輸液裝置上,讓導(dǎo)管內(nèi)充滿溶液。給動物靜脈注射肝素(500U/kg),使全身肝素化,分離出一段頸總動脈,在其下穿兩根線備用。將動脈遠心端的線結(jié)扎,用動脈夾夾住近心端,兩端間的距離盡可能長。用眼科剪在靠遠心端結(jié)扎線處的動脈上呈45o度剪一小口,約為管徑的1/3或1/2,向心臟方向插入動脈導(dǎo)管,用近心端的備用線,在插入口處將導(dǎo)管與血管結(jié)扎在一起,其松緊以開放動脈夾后不致出血為度。小心緩慢放開動脈夾,如有出血,即將線再扎緊些,但仍以導(dǎo)管能抽動為宜。將導(dǎo)管再送入2~3cm并結(jié)扎更緊些,使導(dǎo)管不致脫落。用遠心處的備用線圍繞導(dǎo)管打結(jié)、固定。操作完畢后將血管放回原處(圖4-1)。圖4-1頸總動脈插管示意圖輸尿管插管恥骨聯(lián)合上緣向上沿正中線作4cm長皮膚切口,再沿腹白線剪開腹壁及腹膜(勿傷
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