實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)

關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)第1頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2第一節(jié)概述生物工程：

按照工程學(xué)原理，對(duì)生物體或生物大分子進(jìn)行改造或利用，用于生產(chǎn)、研究、檢定和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)。遺傳（基因）工程蛋白質(zhì)工程酶工程細(xì)胞工程微生物工程胚胎工程組織工程

分子水平細(xì)胞水平組織水平第2頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3胚胎工程（Embryonicengineering）又稱胚胎技術(shù),是指用工程學(xué)的原理對(duì)動(dòng)物的胚胎進(jìn)行某種技術(shù)操作或改造，使之獲得人們所需要?jiǎng)游锏囊幌盗猩锛夹g(shù)的總稱,包括以下四大技術(shù)體系：一、胚胎操作基本技術(shù)

1.超數(shù)排卵和卵母細(xì)胞、精子、受精卵的采集

2.體外受精

3.胚胎性別控制

4.胚胎分割

5.胚胎培養(yǎng)

6.胚胎移植

7.胚胎冷凍保存二、體細(xì)胞克隆技術(shù)三、干細(xì)胞技術(shù)四、外源基因?qū)爰夹g(shù)第3頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三41．在畜牧業(yè)方面：通過(guò)建立超數(shù)排卵、受精卵/卵母細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細(xì)胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家畜品種的改良。

胚胎工程的應(yīng)用第4頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5已在乳腺表達(dá)的生物活性蛋白并進(jìn)入臨床2期或3期試驗(yàn)：抗凝血酶一Ⅲ抗胰蛋白酶蛋白C乳鐵蛋白乳糖酶2．在生物制藥方面：通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將具有藥用價(jià)值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色體上，使其在乳汁、血液、尿液等體液中表達(dá)。通過(guò)收集、純化這些體液中的生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療某些人類(lèi)的疾病。第5頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三63．在醫(yī)學(xué)方面：通過(guò)建立卵母細(xì)胞的采集、體外受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥的治療；通過(guò)對(duì)胚胎培養(yǎng)和檢測(cè)，剔除具有遺傳性疾病的胚胎，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

4．在生命科學(xué)研究方面：闡明哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)生、發(fā)育機(jī)制等基礎(chǔ)理論

5．在拯救瀕危野生動(dòng)物方面：通過(guò)野生動(dòng)物生殖細(xì)胞和組織的冷凍保存、體細(xì)胞克隆和胚胎移植技術(shù)，擴(kuò)大野生動(dòng)物的種群。第6頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7第二節(jié)胚胎操作基本技術(shù)第7頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三8胚胎操作的整個(gè)過(guò)程局限在胚胎的早期發(fā)育第8頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三9解剖取附睪尾部精子的獲取和培養(yǎng)1.精子的采集

嚙齒類(lèi)小動(dòng)物精子的采集大都從體成熟雄性動(dòng)物的附睪獲取。將動(dòng)物處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。大動(dòng)物的精液采集可采用假陰道或電刺激方法促進(jìn)雄性射精，收集精液。一、精子、卵母細(xì)胞、受精卵的采集和超數(shù)排卵第9頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三102.卵母細(xì)胞和受精卵的采集

在哺乳動(dòng)物中獲得卵母細(xì)胞的途徑有兩條：從體內(nèi)成熟并排到輸卵管中去，需通過(guò)處死動(dòng)物或外科手術(shù)獲??；如果在交配后，則可獲取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或剛死亡的雌性動(dòng)物的卵巢，從卵巢中分離卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而得。小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細(xì)胞/受精卵的方法第10頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三11

3.超數(shù)排卵（Superovolation）技術(shù)：通過(guò)注射激素刺激卵巢大量排卵。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動(dòng)物卵巢大量的卵泡同時(shí)成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十幾倍，一次可獲得大量的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕馬血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三種常用。第11頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三12檢查陰栓：妊娠0.5天中午12時(shí)中午12時(shí)上午8時(shí)24小時(shí)24小時(shí)20小時(shí)注射PMSG注射hCG小鼠超數(shù)排卵程序放到種公鼠籠內(nèi)受精卵注射PMSG注射hCG晚上5-6時(shí)晚上5-6時(shí)24小時(shí)24小時(shí)卵母細(xì)胞采集15小時(shí)第12頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三13

體外受精（Invitrofertilization）是指成熟精子與卵母細(xì)胞在體外環(huán)境下完成受精的過(guò)程。這一過(guò)程包括卵母細(xì)胞的收集或未成熟卵母細(xì)胞的培養(yǎng)成熟、精子的獲取、獲能處理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。

體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）又稱試管嬰兒。

二、體外受精第13頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三14

性別控制的研究，是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項(xiàng)重要的高新技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，可以使畜牧上大動(dòng)物的繁殖按照人們的意愿只生產(chǎn)同一性別動(dòng)物。

在醫(yī)學(xué)上，性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良，為X連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異?；虻话l(fā)病。攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，則可避免男性患兒的出生。三、胚胎性別控制第14頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三15性別控制技術(shù)通過(guò)對(duì)X精子與Y精子分離以控制性別在胚胎移植前對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定以控制性別通過(guò)控制飼料特性、受精環(huán)境如改變精液或陰道的PH值等來(lái)控制性別。第15頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三16（一）分離X精子與Y精子以控制性別分離X精子與Y精子的依據(jù)：X、Y精子在體積、密度、電荷、運(yùn)動(dòng)性和DNA含量、表面抗原等方面存在差異。將X和Y精子分離再通過(guò)人工授精可以有效地達(dá)到性別控制的目的。目前將X和Y精子分離的方法有沉降法、電泳法、免疫法和流式細(xì)胞儀法等。流式細(xì)胞儀法是當(dāng)前分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法，具有重復(fù)性、科學(xué)性和有效性的特點(diǎn)。第16頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三17

應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。對(duì)于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8％，由于染料著色量與精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光就比Y精子強(qiáng)。正常人染色體第17頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三18

具體的做法是：先用DNA特異性染料對(duì)精子進(jìn)行活體染色，然后精子連同少量稀釋液逐個(gè)通過(guò)激光束。探測(cè)器根據(jù)精子的發(fā)光強(qiáng)度把電信號(hào)傳遞給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)指令液滴充電使發(fā)光強(qiáng)度高的液滴帶正電，弱的帶負(fù)電。即X精子帶上正電荷，Y精子帶上負(fù)電荷。當(dāng)經(jīng)過(guò)高壓電場(chǎng)時(shí)會(huì)向不同方向偏轉(zhuǎn)，達(dá)到分離的目的。第18頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三19（二）對(duì)胚胎進(jìn)行鑒定以控制性別

在胚胎移植前對(duì)胚胎的部分組織用染色體檢查、間接免疫熒光法和PCR法進(jìn)行性別鑒定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特點(diǎn)，近年來(lái)得到迅速的發(fā)展。

Y染色體短臂上有決定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determiningregionofY-chromosome,全稱:Y染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別鑒定提供了可靠的途徑。第19頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三20第20頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三21受精卵2細(xì)胞胚4細(xì)胞胚8細(xì)胞胚桑椹胚囊胚

胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過(guò)程的可能性。四、胚胎培養(yǎng)第21頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三22胚胎培養(yǎng)一般應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：

1．未成熟卵母細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)，成熟后進(jìn)行體外受精。

2．受精卵通過(guò)體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷凍保存。

3．冷凍保存胚胎解凍后，通過(guò)體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用于胚胎移植。

4．通過(guò)研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，不斷完善胚胎培養(yǎng)條件，揭示胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和分化的奧秘。目前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以將未成熟卵在體外成熟，并通過(guò)體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。即使如此，在體外胚胎培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動(dòng)物的子宮內(nèi)。第22頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三23---胚胎工程的最后一道工序

將受精卵或發(fā)育到一定時(shí)期的早期胚胎,移植到受體動(dòng)物生殖管道的一定部位,能在子宮內(nèi)著床、生長(zhǎng)、發(fā)育、分娩、出生仔代動(dòng)物的技術(shù)稱為胚胎移植。幾乎所有的胚胎工程技術(shù)在體外完成對(duì)胚胎的操作后，都需經(jīng)過(guò)胚胎移植這一步驟，得到我們所要的動(dòng)物。五、胚胎移植第23頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三24體外培養(yǎng)的胚胎必須移植到同步發(fā)情的雌性動(dòng)物生殖管道內(nèi)。解決同步發(fā)情的方法有兩種：1.利用自然同期發(fā)情的母畜，此法在實(shí)踐上較難辦到；2.通過(guò)注射某些藥物(如孕激素、雌激素等)誘發(fā)同期發(fā)情。

不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。受精卵和2細(xì)胞胚胎應(yīng)移植到輸卵管內(nèi)，而桑椹胚和囊胚期胚胎應(yīng)移植到子宮內(nèi)，以跟正常妊娠生殖生理變化同步。第24頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三25同一種屬內(nèi)的不同品種品系可互相進(jìn)行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封閉群ICR的生殖管道內(nèi)；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西蘭兔的生殖管道內(nèi)。這一特點(diǎn)在畜牧業(yè)特別有用，如為了加快良種奶牛的繁殖，可將良種奶牛的胚胎移植到普通黃牛的生殖管道內(nèi)，借腹懷胎。第25頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三26

胚胎冷凍保存（embryocryopreservation）技術(shù)是指在低溫（-196℃液氮內(nèi)）條件下利用低溫保護(hù)劑保存生殖細(xì)胞及胚胎的一門(mén)技術(shù)。六、胚胎冷凍保存第26頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三27（一）胚胎冷凍保存的機(jī)制

低溫降低了胚胎內(nèi)的生化反應(yīng)速度。并且溫度越低，保存時(shí)間就越長(zhǎng)。低溫?fù)p傷：如果冷卻速度過(guò)慢，胞外溶液中水分大量結(jié)冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致細(xì)胞的強(qiáng)烈收縮和細(xì)胞處于高濃度的溶液中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，從而造成化學(xué)損傷；如果冷卻速度過(guò)快，胞內(nèi)水分來(lái)不及通過(guò)細(xì)胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液過(guò)冷而結(jié)冰，從而造成物理?yè)p傷。

同樣，在復(fù)溫（解凍）過(guò)程中，如果復(fù)溫速率不當(dāng)也可能引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰（重結(jié)冰）而損傷。第27頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三28

采用低溫保護(hù)劑防止低溫?fù)p傷：

二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等可以避免或減少結(jié)冰的程度與速度，降低細(xì)胞周?chē)磧鼋Y(jié)溶液中的電解質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過(guò)程中所發(fā)生的物理和化學(xué)損傷。第28頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三29

（二）胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用

1.應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保種和珍稀或?yàn)l危動(dòng)物種質(zhì)保存。⒉應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎的長(zhǎng)途運(yùn)輸。⒊應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化。⒋應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種和野生動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化。第29頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三30第三節(jié)動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)第30頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三31

克隆（clone）的概念克隆是指無(wú)性繁殖或拷貝。無(wú)性生殖在植物中很常見(jiàn)，在動(dòng)物中過(guò)去認(rèn)為是不可能的。動(dòng)物克隆是指生物體通過(guò)體細(xì)胞核移植生產(chǎn)出基因型幾乎與供體完全相同的后代。第31頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三32

核移植（Nucleartransfer）是指將動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核移植到另一個(gè)體的去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，通過(guò)電激活，使供體核重編程序，形成的重構(gòu)卵發(fā)育成胚胎，最后通過(guò)胚胎移植，使之發(fā)育成個(gè)體。如果受體去核卵和供體移入的核來(lái)自同種動(dòng)物，則稱種內(nèi)核移植，來(lái)自不同的種則稱為種間核移植。核移植由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)精子和卵子的受精過(guò)程，核移植動(dòng)物的全部遺傳信息來(lái)自供體核細(xì)胞，等于是復(fù)制了提供細(xì)胞核的動(dòng)物，因而把它俗稱為“克隆”。

第32頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三33

根據(jù)供體核的來(lái)源不同，核移植包括以下幾種：

胚胎細(xì)胞核移植：未著床的囊胚（未分化）胚胎干細(xì)胞核移植（未分化）胎兒成纖維細(xì)胞：出生前的胎兒（未分化或低分化）成年體細(xì)胞（已分化）第33頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三34動(dòng)物克隆的實(shí)驗(yàn)過(guò)程第34頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三35動(dòng)物克隆技術(shù)的意義與應(yīng)用加快良種家畜的繁殖速度與體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，能制備大家畜轉(zhuǎn)基因動(dòng)物拯救瀕危野生動(dòng)物治療性克隆，用于再生醫(yī)學(xué)第35頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三36再生醫(yī)學(xué)技術(shù)路線簡(jiǎn)介第36頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三37第四節(jié)干細(xì)胞技術(shù)第37頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三38一、概述干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(adultstemcells，AS細(xì)胞)。ES細(xì)胞存在于囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，是全能性、無(wú)限增殖的干細(xì)胞，在胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有分化形成胎兒所有類(lèi)型細(xì)胞、組織和器官的潛能。AS細(xì)胞是ES細(xì)胞定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的“種子”，具有自我更新和分化為組織特異細(xì)胞的能力，即分化為相應(yīng)組織和器官中細(xì)胞的“專(zhuān)能”細(xì)胞，包括神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、精原干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞等。第38頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三39第39頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三40誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS細(xì)胞)2006年,Takahashi等首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基因能夠使已分化的細(xì)胞重編程回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)。他們通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細(xì)胞,獲得了具有強(qiáng)大的自我更新能力和分化潛能的多能性干細(xì)胞,命名為“誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞”

(Inducedpluripotentstemcells,iPS細(xì)胞)。這一研究克服了ES細(xì)胞和AS細(xì)胞應(yīng)用存在的諸多問(wèn)題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細(xì)胞主要有血細(xì)胞(如T細(xì)胞和B細(xì)胞等)、脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞。第40頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三41二、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞)來(lái)源：ES細(xì)胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚胎受精后約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的內(nèi)細(xì)胞群分離出來(lái)的未分化細(xì)胞。內(nèi)細(xì)胞群:具有未分化特性，可進(jìn)一步分裂,分化形成內(nèi)、中、外三個(gè)胚層。外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等，中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織，內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群分離出來(lái)后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，我們稱之為ES細(xì)胞。第41頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三42

目前除了從小鼠、大鼠和人分離得到并建立ES細(xì)胞系外，還未從其它動(dòng)物的囊胚中分離到ES細(xì)胞系。第42頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三43

（二）ES細(xì)胞的培養(yǎng)

ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對(duì)培養(yǎng)液、試劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級(jí)，對(duì)培養(yǎng)器皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合，ES細(xì)胞容易發(fā)生分化，從而失去ES細(xì)胞的特性。

未分化ES細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素處理過(guò)的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（Feedercell）共培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞為ES細(xì)胞提供細(xì)胞因子來(lái)維持其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）能更有效地維持未分化的ES細(xì)胞。第43頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三44（三）ES細(xì)胞的鑒定

ES細(xì)胞是一種正常的胚胎性干細(xì)胞，具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能。在建系之初需要對(duì)其核型、分化能力和細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒定

1．核型

2．體外分化試驗(yàn)將ES細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù)天后形成胚樣小體（embryoidbodies）的內(nèi)皮樣大型細(xì)胞團(tuán)；向成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及造血細(xì)胞的分化。

3．體內(nèi)分化試驗(yàn)將ES細(xì)胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下，2周后注射部位出現(xiàn)腫塊，病理檢查為畸胎瘤?；チ鰞?nèi)部有多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及干細(xì)胞集落等，也可看到各胚層組織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。

4．ES細(xì)胞的標(biāo)志物

Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）屬POU轉(zhuǎn)錄因子一員，它在全能胚胎干細(xì)胞(ES)和生殖細(xì)胞表達(dá)。該表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化導(dǎo)致Oct-4的下調(diào)。

SSEAs:人ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-3和SSEA-4，但不表達(dá)SSEA-1。小鼠ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-1，但不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。

第44頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三45（四）胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用1.用于研究哺乳動(dòng)物個(gè)體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律

由于ES細(xì)胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外胚層中任何一種類(lèi)型細(xì)胞，因此可用遺傳標(biāo)記的ES細(xì)胞(如標(biāo)記半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通過(guò)組織化學(xué)染色追蹤ES細(xì)胞的分化特點(diǎn)，探索胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的ES細(xì)胞已成為研究哺乳動(dòng)物早期發(fā)育規(guī)律的重要工具之一。第45頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三46

2.在體外研究細(xì)胞的分化規(guī)律

ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白細(xì)胞介素-6(IL-6)的培養(yǎng)液中維持不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生不同類(lèi)型的分化，通過(guò)研究ES的分化特點(diǎn)可揭示細(xì)胞分化和凋亡機(jī)理。第46頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三473.用于研究基因的功能和制備基因敲除動(dòng)物

由于用ES細(xì)胞可進(jìn)行基因打靶，容易獲得基因敲除或定向插入外源基因的ES細(xì)胞，因此是基因敲除和基因插入的首選細(xì)胞。通過(guò)篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，然后用嵌合體或細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用于研究未知基因的生物學(xué)功能。第47頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三484.治療人類(lèi)的某些難治性疾病

人類(lèi)由于細(xì)胞壞死、退化或功能異常引起的疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆癥等，已成為醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。利用ES細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織細(xì)胞的特性，移植ES細(xì)胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù)正常功能。目前，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，用ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的某些組織細(xì)胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。第48頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三495.培育出人造組織器官，用于器官移植

隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫排斥的問(wèn)題。第49頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三50三、成體干細(xì)胞1.成體干細(xì)胞（AS細(xì)胞）的來(lái)源AS細(xì)胞位于出生后體內(nèi)分化成熟的組織之中，具有自我更新和分化潛能，它在分裂時(shí)可產(chǎn)生兩個(gè)子代細(xì)胞，一個(gè)與原來(lái)干細(xì)胞完全一致，另一個(gè)向前分化，形成相應(yīng)組織的多功能干細(xì)胞，通過(guò)分化增殖和更新衰老細(xì)胞來(lái)構(gòu)筑相應(yīng)的器官，維持正常生理功能。現(xiàn)在可從骨髓和血液、胎盤(pán)、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪、滑膜等多種組織中獲取各種多能干細(xì)胞。第50頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三512.AS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化取所要分離AS細(xì)胞的組織，用酶消化法分散細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。再用各種技術(shù)從體外培養(yǎng)細(xì)胞中分離AS細(xì)胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺AS細(xì)胞。同ES細(xì)胞一樣，AS細(xì)胞的誘導(dǎo)定向分化需要細(xì)胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）等。通常情況下，供體干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來(lái)源一致的細(xì)胞。然而在某些情況下干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律，如神經(jīng)外胚層來(lái)源的NSC能分化為中胚層來(lái)源的細(xì)胞如肌細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血細(xì)胞系等。所有干細(xì)胞中，來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞在多向性分化方面具有較大的潛能，分為造血干細(xì)胞(HSC)和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。第51頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三523.AS細(xì)胞的鑒定各種AS細(xì)胞都有自己的標(biāo)記物，可利用標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。4.AS細(xì)胞的應(yīng)用疾病的替代治療和移植治療

如用造血干細(xì)胞治療白血病，造血干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞來(lái)修復(fù)受損傷的心肌，治療心力衰竭。骨髓來(lái)源干細(xì)胞及其他來(lái)源干細(xì)胞都可以分化得到成骨細(xì)胞，通過(guò)將細(xì)胞與支架材料結(jié)合后移植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。第52頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三53四、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞1.iPS細(xì)胞的來(lái)源iPS細(xì)胞建立的過(guò)程主要包括:①

分離和培養(yǎng)宿主細(xì)胞；②

通過(guò)病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個(gè)多能性相關(guān)的基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）導(dǎo)入宿主細(xì)胞；③

將病毒感染后的細(xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上,用ES細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)體系中培養(yǎng),同時(shí)在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng)的小分子化合物，以促進(jìn)重編程。2.iPS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化其培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)定向分化的條件基本與ES細(xì)胞相同。3.iPS細(xì)胞的鑒定iPS細(xì)胞的鑒定與ES細(xì)胞相同。第53頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三54如何獲得人ES細(xì)胞傳統(tǒng)技術(shù)1.用病人的皮膚細(xì)胞核移植到人去核卵母細(xì)胞人卵母細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題2.用病人的皮膚細(xì)胞核移植到動(dòng)物去核卵母細(xì)胞倫理問(wèn)題新技術(shù)1.用ES細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄基因?qū)肴似つw細(xì)胞，直接轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）(2007年）安全問(wèn)題2.miRNAs直接將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS(2010年）以病毒為載體，向老鼠的成纖維細(xì)胞中注入4個(gè)基因，將其改造為ｉＰＳ細(xì)胞，然后在此基礎(chǔ)上培育出一個(gè)老鼠胚胎，再把它植入代孕實(shí)驗(yàn)鼠的體內(nèi)。20天后，一只黑色的小老鼠出生。第54頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三554.iPS細(xì)胞的應(yīng)用iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞相比,具有很多優(yōu)勢(shì)。iPS細(xì)胞的來(lái)源更方便、更豐富，可以通過(guò)有限的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)染直接誘導(dǎo)各種不同動(dòng)物的體細(xì)胞來(lái)獲取多能性干細(xì)胞，而不需要通過(guò)ES細(xì)胞途徑，克服了許多動(dòng)物至今未分離出ES細(xì)胞的問(wèn)題。iPS細(xì)胞的產(chǎn)生不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克服了使用人胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的倫理問(wèn)題，可見(jiàn)iPS細(xì)胞必然成為未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)的研究熱點(diǎn)。目前,科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS細(xì)胞。第55頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三56第五節(jié)外源基因?qū)肱咛ゼ夹g(shù)

第56頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三57

將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾種方法：一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi)①顯微注射法：在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA直接注入到受體的受精卵雄性原核內(nèi)。②逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細(xì)胞時(shí)，外源基因可整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。

③精子載體法：將外源DNA與動(dòng)物精子一起孵育，在體外受精過(guò)程中由精子將外源DNA帶入卵內(nèi)。

第57頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三58二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為供體核移植到去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎。

1.將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞：

①電穿孔法：細(xì)胞暴露于高電壓時(shí)，細(xì)胞膜為高電壓瞬時(shí)擊穿，從而使外源DNA被攝入細(xì)胞中。②脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源DNA裝入脂質(zhì)體，與培養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，即可將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。③基因槍法：

④DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法：⑤磷酸鈣介導(dǎo)法：

第58頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三592.帶有外源基因的ES細(xì)胞通過(guò)崁合體技術(shù)進(jìn)入囊胚胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類(lèi)胚胎或胚細(xì)胞組合起來(lái)，由此而發(fā)育形成的動(dòng)物稱為嵌合體動(dòng)物。由于嵌合體動(dòng)物是兩類(lèi)遺傳背景不同的胚胎發(fā)育形成的，不同細(xì)胞群體互相嵌合構(gòu)成了器官和組織，但嵌合體動(dòng)物攜帶的兩種遺傳特性不能同時(shí)遺傳給下一代的同一個(gè)體。究竟哪一個(gè)親本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細(xì)胞是否在嵌合體動(dòng)物體內(nèi)分化成生殖細(xì)胞（精子或卵子）。分化成生殖細(xì)胞的親本的遺傳特性能傳給后代。第59頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三60嵌合體動(dòng)物的制備：1.聚合法用聚合法制作嵌合體動(dòng)物，是將遺傳上不同（例如毛色不同）的兩個(gè)8～16細(xì)胞胚胎用物理方法聚合起來(lái)。2.注射法

注射法是將胚胎干細(xì)胞或其他胚細(xì)胞注入桑椹胚或囊胚腔中來(lái)制作嵌合體動(dòng)物。第60頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三613.帶有外源基因的體細(xì)胞通過(guò)克隆技術(shù)進(jìn)入胚胎將帶有外源基因的體細(xì)胞作為供體，通過(guò)核移植技術(shù)克隆到去核卵母細(xì)胞，在體外發(fā)育成囊胚，再移植到假孕動(dòng)物的子宮中。出生后動(dòng)物的基因型與供體的基因型完全一致。第61頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三62

外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)

外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后有三種命運(yùn)：

1．被胞內(nèi)酶降解。

2．以游離狀態(tài)存在。游離的未整合外源DNA只要有真核細(xì)胞能識(shí)別的啟動(dòng)子、編碼基因以及poly(A)信號(hào)等，一般都能得到表達(dá)，但隨著細(xì)胞衰老，表達(dá)力下降。這種表達(dá)不能傳代，稱為暫時(shí)表達(dá)。

3．整合到受體細(xì)胞染色體（只有少數(shù)）。整合到受體細(xì)胞基因組的外源基因，能隨細(xì)胞分裂遺傳到子細(xì)胞，稱為穩(wěn)定表達(dá)。第62頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三63DNA構(gòu)件導(dǎo)入細(xì)胞的方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因電穿孔電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞或早期胚胎ES細(xì)胞體細(xì)胞隨機(jī)整合定點(diǎn)整合或隨機(jī)整合定點(diǎn)整合或隨機(jī)整合第63頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星期三64

外源基因整合到受體細(xì)胞染色體可分為以下兩種情況：①隨機(jī)插入（Randominsertion）：外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，隨機(jī)插入到任意的染色體內(nèi)。如果插入到一個(gè)基因內(nèi)，可能導(dǎo)致該基因的失活。另外，插入外源基因受鄰近調(diào)控序列的影響，其表達(dá)可能高，也可能低。②定點(diǎn)整合（Targetedintegration）：實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點(diǎn)整合部位的同源DNA序列，即所謂的同源臂（Homologousarm）。當(dāng)外源基因載體進(jìn)入細(xì)胞后，同源臂序列與宿主染色體上的相同序列相互靠近，通過(guò)同源重組，將外源基因載體置換到染色體相應(yīng)的位置上，實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合。我們把這種技術(shù)形象地稱之為“基因打靶”。第64頁(yè)，共71頁(yè)，2023年，2月20日，星