實(shí)驗(yàn)五一些試劑對(duì)四膜蟲影響的觀察

關(guān)于實(shí)驗(yàn)五一些試劑對(duì)四膜蟲影響的觀察第1頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解生存環(huán)境對(duì)生命的重要意義。2、比較各種因素對(duì)四膜蟲細(xì)胞的影響。第2頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞生存需要一定的條件。四膜蟲也不例外。其形態(tài)比較固定，細(xì)胞較大，它的纖毛和伸縮泡及其本身都在不停的運(yùn)動(dòng)。一旦條件發(fā)生變化，四膜蟲所發(fā)生的反應(yīng)馬上就可以被觀察到。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一些常見(jiàn)的化學(xué)試劑，以不同的濃度對(duì)四膜蟲進(jìn)行處理，觀察較短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞所產(chǎn)生的效應(yīng)。第3頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1、酸和堿每種生物對(duì)環(huán)境的酸堿度都有一定的影響，水生生物（包括四膜蟲）和培養(yǎng)的組織細(xì)胞更是如此。酸堿度超過(guò)一定的限度，對(duì)細(xì)胞的生存不利，甚至?xí)⑵錃⑺溃∩詈：Ｋ乃釅A度約為pH8左右。大面積的淡水水域酸堿度也較穩(wěn)定，約在pH6～9之間。海洋和湖泊等水域有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)pH的能力。這是由于水域中存在著H2CO3和碳酸鹽的緩沖系統(tǒng)。即使局部地區(qū)發(fā)生了pH的變化，在一定范圍內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間也能通過(guò)這一緩沖系統(tǒng)而恢復(fù)正常。但是如果環(huán)境污染(酸雨、廢酸排放)超過(guò)了水域的調(diào)節(jié)能力，水域的pH就要發(fā)生變化，生物的生存和發(fā)育就要受到影響。酸堿度的改變對(duì)生物的生長(zhǎng)生殖和活動(dòng)都能發(fā)生影響。例如，綠草履蟲(Parameciumbarsaria)，在酸性的培養(yǎng)液中(pH6.0～6.3)，體長(zhǎng)可達(dá)120μm，在堿性培養(yǎng)液中(pH7.6～8.0)，體長(zhǎng)只有86μm。海膽卵在pH6.2的水中不能受精，pH低于4.6時(shí)死亡。各種微生物都有其最適酸堿度。酵母和霉菌適宜在微酸性環(huán)境中。也有少數(shù)可以在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性環(huán)境中生存。第4頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三氧化劑可使蛋白質(zhì)變性，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，在濃度較高時(shí)能迅速殺死細(xì)胞。常用的消毒劑如次氯酸鈉、雙氧水都是強(qiáng)氧化劑。強(qiáng)氧化劑的殺菌作用：強(qiáng)氧化劑容易同細(xì)菌的細(xì)胞壁中的脂蛋白或細(xì)胞膜中的磷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到破壞（即所謂的溶菌作用），細(xì)胞膜的通透性增加，且氧化劑迅速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，氧化了細(xì)胞內(nèi)酶或RNA、DNA，從而致死菌原體。巰基乙醇是常用的還原劑，微量巰基乙醇可防止某些生物活性物質(zhì)的活性基團(tuán)及酶的活性中心受到破壞。巰基試劑在生化反應(yīng)中有兩個(gè)用途，一是防止蛋白質(zhì)或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反應(yīng)中維持體系的還原環(huán)境。經(jīng)常應(yīng)用的巰基試劑有二硫丁醇類化合物（如二硫蘇糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巰基乙醇，谷胱甘肽也經(jīng)常應(yīng)用。巰基乙醇有毒！對(duì)環(huán)境有危害，對(duì)水體可造成污染。

2、氧化劑和還原劑第5頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三去垢劑是一些具有親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈分子。非離子型去垢劑如TritonX-100可與脂雙層形成混合微團(tuán)，它們主要與蛋白質(zhì)疏水部位相互作用，一般不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。而離子型去垢劑與蛋白結(jié)合后可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使之變性，尤其是加熱后可使蛋白質(zhì)解離為單體，如十二烷基磺酸鈉（SDS）等。3、去垢劑第6頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三去垢劑能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞損傷、功能喪失，甚至引起死亡。非離子型去垢劑通過(guò)溶解膜上的脂蛋白和磷脂類化合物等，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變。第7頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4、高滲溶液

滲液壓對(duì)細(xì)胞的影響：水通過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)方向主要決定于細(xì)胞外環(huán)境的滲透壓。在正常情況下細(xì)胞外的滲透壓與細(xì)胞內(nèi)滲透壓處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞維持正常的形態(tài)與生理功能。高滲液可使細(xì)胞失水，引起細(xì)胞形態(tài)/功能的改變；低滲液可使細(xì)胞膨脹，甚至破裂。第8頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

細(xì)胞膜具有對(duì)物質(zhì)選擇透過(guò)的生理功能。脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越?。环菢O性分子比極性容易透過(guò)，小分子比大分子容易透過(guò)。水分子可通過(guò)水通道進(jìn)出細(xì)胞膜；非極性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透過(guò)脂雙層，不帶電荷的極性小分子，如尿素、甘油等也可以透過(guò)人工脂雙層，盡管速度較慢，分子量略大一點(diǎn)的葡萄糖、蔗糖則很難透過(guò)，而膜對(duì)帶電荷的物質(zhì)如：H+、Na+、K+、Cl—、HCO3—是高度不通透的。不同分子透過(guò)人工脂雙層的能力第9頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

水通道是處于持續(xù)開放狀態(tài)的膜通道蛋白，水分子的轉(zhuǎn)運(yùn)不需消耗能量，也不受門控機(jī)制影響。水分子通過(guò)水通道的移動(dòng)方向完全由膜兩側(cè)的滲透壓差決定，水分子從滲透壓低的一側(cè)向滲透壓高的一側(cè)移動(dòng)，直到兩側(cè)滲透壓達(dá)到平衡。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白APO1（引自/）第10頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四膜蟲為淡水性原生生物，有伸縮泡來(lái)調(diào)節(jié)滲透平衡，耐低滲，但高滲對(duì)其有影響！可注意觀察在不同濃度蔗糖和NaCl溶液中細(xì)胞發(fā)生的變化！第11頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5、有毒物質(zhì)疊氮鈉：劇毒，可強(qiáng)烈地抑制并阻斷線粒體中細(xì)胞色素電子運(yùn)送系統(tǒng)。甲醛：能使蛋白質(zhì)變性，常作為防腐劑、固定劑使用。第12頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三6、其他物質(zhì)DMSO二甲亞砜，是一種溶于水又溶于有機(jī)溶劑的極為重要的非質(zhì)子極性溶劑；也是一種滲透性保護(hù)劑，能夠降低細(xì)胞冰點(diǎn)，減輕自由基對(duì)細(xì)胞損害，改變生物膜對(duì)電解質(zhì)、藥物、毒物和代謝產(chǎn)物的通透性。研究表明，DMSO存在嚴(yán)重的毒性作用，與蛋白質(zhì)疏水集團(tuán)發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。DMSO用的時(shí)候要避免其揮發(fā)，要準(zhǔn)備1%-5%的氨水備用，皮膚沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗滌。第13頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三材料：

1、四膜蟲培養(yǎng)液

一種單細(xì)胞原生動(dòng)物，主要產(chǎn)自淡水，一般呈倒卵形或梨形，具有兩個(gè)細(xì)胞核?？稍?0倍鏡下輕松地觀察其細(xì)胞形態(tài)及運(yùn)動(dòng)等方面的變化。

2、各種試劑

1mol/LNaOH；1mol/LHCl；1%甲醛；1%TritonX-100；1%SDS；1%次氯酸鈉；1%巰基乙醇；1%DMSO；0.25mol/L蔗糖；0.15mol/LNaCl；蒸餾水。器材：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、牙簽二、試劑和器材第14頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三試劑：

本實(shí)驗(yàn)涉及試劑較多，且大多為無(wú)色透明液體。實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意小離心管表面的標(biāo)簽，以免搞錯(cuò)試劑！并請(qǐng)大家用記號(hào)筆分別在離心管閉上做好記號(hào)！第15頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、實(shí)驗(yàn)操作

（一）觀察正常狀態(tài)下的四膜蟲試劑：四膜蟲培養(yǎng)液1、在一干凈載玻片上滴加四膜蟲培養(yǎng)液10μl。不加蓋玻片，在10倍鏡下觀察四膜蟲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，然后加上蓋玻片用40倍鏡觀察，注意四膜蟲纖毛和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)，特別是伸縮泡的運(yùn)動(dòng)節(jié)奏，記錄現(xiàn)象。

第16頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）各種試劑對(duì)四膜蟲的影響（以NaOH為例）1、取1mol/LNaOH的小離心管（標(biāo)記為A1）和3只空白1.5ml離心管，在空白管外側(cè)用記號(hào)筆標(biāo)記好A0.1、A0.01和A0.001，并用移液槍在空白管中各加入900μl蒸餾水。2、從A1管中準(zhǔn)確吸取100μl液體，加入A0.1管中，吹打混勻。再?gòu)腁0.1管中準(zhǔn)確吸取100μl液體，加入A0.01管中。重復(fù)操作，直到最后一管。操作過(guò)程中不必更換槍頭！第17頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三A1A0.1A0.01A0.001100μl100μl100μl第18頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3、取兩片干凈載玻片，左側(cè)標(biāo)記為A1，右側(cè)標(biāo)記為A0.1；另外取兩片干凈載玻片，左側(cè)標(biāo)記為A0.01，右側(cè)標(biāo)記為A0.001。4、用同一槍頭，依次從濃度最低的A0.001開始，分別吸取50μl液體，滴加在載玻片上已標(biāo)記出的相應(yīng)位置上，不要涂開！A1A0.1A0.01A0.001第19頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5、用裝有四膜蟲培養(yǎng)液的小塑料瓶從濃度最低的A0.001開始，一次在每一50μl的液滴上滴加一滴四膜蟲培養(yǎng)液（約20~30μl），馬上用牙簽將其混勻，直到濃度最高的樣，不必更換牙簽！6、混合了最后一個(gè)樣后，立即開始計(jì)時(shí)，馬上將樣品在10倍鏡下觀察，先從濃度高的開始，將各濃度依次觀察，記錄現(xiàn)象。每組兩個(gè)同學(xué)各觀察1張載玻片！A0.01A0.001第20頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7、如在觀察濃度最高的樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)太快而無(wú)法觀察仔細(xì)，可做如下處理：另取干凈載玻片，先滴加50μl濃度最高的試劑，在其近旁滴加一滴四膜蟲培養(yǎng)液，注意勿使兩液混合。將載玻片放顯微鏡下，觀察到四膜蟲后用牙簽將兩者混合，立即觀察！50μlA1液體四膜蟲第21頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三后面的試劑可如NaOH一樣操作，分別標(biāo)記如下：A1mol/LNaOHB1mol/LHClC0.1%TritonX-100D0.1SDSE1%次氯酸鈉F1%巰基乙醇G1%甲醛H0.25mol/L蔗糖I0.15mol/LNaClJ1%DMSO第22頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三按表記錄觀察結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)記錄試劑稀釋度觀察到的變化細(xì)胞形態(tài)運(yùn)動(dòng)情況其他時(shí)間NaOH(A)10.10.010.001第23頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、注意事項(xiàng)

1、四膜蟲為淡水性原生生物，可承受一定的低滲壓。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇培養(yǎng)約3天的四膜蟲培養(yǎng)液，一則細(xì)胞數(shù)目較多，二則細(xì)胞比較新鮮。如培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久，大部分細(xì)胞處于衰老期，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)不明顯。2、加入去垢劑后四膜蟲細(xì)胞發(fā)生變化非?？?，需立即觀察。非離子型去垢劑和離子型去垢劑對(duì)細(xì)胞膜作用的效果有所不同，可進(jìn)行比較。3、四膜蟲的細(xì)胞比較大，可在低倍鏡下觀察其生理狀態(tài)，但如沒(méi)有經(jīng)過(guò)固定染色，應(yīng)將光線適當(dāng)調(diào)暗，以方便觀察。4、如要準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，最好準(zhǔn)備秒表。第24頁(yè)，共27頁(yè)，2023年，2月20日，星期三在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中按自己的觀察結(jié)果回答下列問(wèn)題：1.四膜蟲更耐酸還是堿？酸和堿何者對(duì)四膜蟲的破壞大？2.氧化劑和還原劑何者對(duì)四膜蟲的影響大？3.SDS與TritonX-100