光合細(xì)菌Rhodoseudomonasacidohila的胞外聚合物的提取

光合細(xì)菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物的提取研究摘要：采用了五五種不同的方方法——EDTA、NaOH、H2SO4、熱提取和和高速離心，對(duì)對(duì)光合細(xì)菌RRhodoppseudoomonassaciddophilla的胞外聚聚合物（EPS）進(jìn)行提取取。結(jié)果表明，EDTA法是一種比較較好的提取方方法，提取效效率高，對(duì)細(xì)細(xì)胞破壞小。EPS中的多糖、蛋蛋白和核酸含含量分別為6.5、58.4、5.4mmg/g干重。EDTA的適宜提取時(shí)間1～3h，用量約為2.8gg/g干重。采用用不同的提取取方法，提取取的EPS中的組分含量大不不相同。本文文還采用了兩兩種方法檢查查細(xì)胞的破壞壞程度，一種種是測(cè)定核酸酸含量，一種種是測(cè)定光合合細(xì)菌提取前前后UV-Viis光譜和EPS的UV-Viis光譜，兩種種方法的結(jié)果果一致。EDTA提取方法中中，細(xì)菌的UV－Vis峰強(qiáng)度在提提取前后沒(méi)有有變化，EPS溶液中也沒(méi)沒(méi)有新的色素素峰出現(xiàn)，說(shuō)說(shuō)明基本沒(méi)有有細(xì)胞被破壞壞。由于UV－Vis光譜測(cè)定方方便快速，可可以用來(lái)監(jiān)測(cè)測(cè)在EPS提取過(guò)程中中細(xì)胞的溶解解情況。關(guān)鍵詞：胞外聚聚合物；光合合細(xì)菌；UV-Viis光譜；蛋白白；核酸；多多糖；提取ExtracttionooftheeextrracelllularpolymmericsubsttancessfrommaphhotosyynthetticbaacteriiumRhoodopseeudomoonasaacidopphilaAbstracct:Ammongtthefiivemeethodssforextraactinggextrracelllularpolymmericsubsttancess(EPSS)froomRhoodopseeudomoonasaacidopphilausinggEDTAA,NaOOH,H2SO4,heaatingandhhighsspeedcentrrifugaation,,EDTAAextrractioonwassfounndtobethhemosstefffectivvemetthodbbecausseofhigheerexttractiioneffficieencyaandloowerccellllysis..TheconteentsooftheemajoorcommponenntsoffEPSfromRR.aciidophiila,i..e.,ccarbohhydratte,prroteinnandnucleeicaccid,weere6.55,58..4andd5.4mg/gdryccell,respeectiveely.TThefeeasiblleexttractiiontiimewaas1-33hanndtheeEDTAAdosaagewaasaboout2..8g/ggdrycellssforEDTAextraactionn.Twomethoods,ii.e.tthecoontenttofnnucleiicaciidanddUV-VVissppectruum,weereussedtooevalluatecelllysissduriingexxtracttion.TheaabsorpptionpeakssforphotoosynthheticpigmeentsiinUV--VissspectrrumseeemednochhangepriorrtoaandaffterEEDTAeextracction,,andnopiigmenttpeakksapppeareddintthesppectruumofEPS,indiccatinggthattfewcellsswereedesttroyeddandthatlysissdidnotooccurdurinngEDTTAexttractiion.TTheUVV-VisspecttrumccouldbeussedtoomoniitorttheceelllyysisdduringgEPSextraactionnfrommRaciddophilla.Keywordds:Caarbohyydratee;Exttracelllularrpolyymericcsubsstancees;Exxtracttion;Nucleeicaccid;RRhodoppseudoomonassaciddophilla;UVV-Visspecttrum;Proteein微生物利用有機(jī)機(jī)廢水產(chǎn)氫已已經(jīng)引起了人人們廣泛的興興趣，其中光光合細(xì)菌（PSB）被認(rèn)為是是最有應(yīng)用前前景的一種產(chǎn)產(chǎn)氫微生物，文文獻(xiàn)中報(bào)道一一些光合細(xì)菌菌，例如Rhhodobaactersp.[11]，能夠利用低低級(jí)有機(jī)酸作作為電子受體體，光作為能能源，產(chǎn)生氫氫氣。從應(yīng)用用觀點(diǎn)看，光光合細(xì)菌要能夠在光反反應(yīng)器中生長(zhǎng)長(zhǎng)和連續(xù)產(chǎn)氫氫，反應(yīng)器中中微生物必須須保持一定的的濃度，但是是，由于光合合細(xì)菌的絮凝凝沉降性能不不好[2]，不能能有效的和溶溶液分離，在在產(chǎn)氫光反應(yīng)應(yīng)器中，光合合細(xì)菌一般濃濃度都很低。為為了解決這個(gè)個(gè)問(wèn)題，必須須研究PSB的絮凝沉降降特性。細(xì)菌的絮凝性能能和胞外聚合合物（EPS）有很大的的關(guān)系。EPS是吸附在細(xì)細(xì)菌表面的一一些高分子聚聚合物（Mw>100000），主要來(lái)來(lái)源是微生物物分泌、細(xì)胞胞產(chǎn)物自溶和和廢水中的有有機(jī)物的吸附附[3]。EPS的主要成分分是多糖、蛋蛋白和核酸，它它們的含量對(duì)對(duì)細(xì)菌的絮凝凝性能有著顯顯著的影響。EPS的研究最早早應(yīng)用于好氧氧活性污泥中中，到目前為為止，對(duì)水處處理中好氧活活性污泥和厭厭氧污泥、顆顆粒污泥、生生物膜等已經(jīng)經(jīng)進(jìn)行了大量量的研究[4－6]，但是對(duì)光光合細(xì)菌的EPS特性研究很很少。Watannabe等人[2]分離了了一株海洋光光合細(xì)菌，RRhodovvulumsp.，并且研究究了它的絮凝凝特性，他們們認(rèn)為胞外核核酸的含量是是影響光合細(xì)細(xì)菌絮凝性能能的最主要因因素，但該株株細(xì)菌能不能能產(chǎn)氫沒(méi)有報(bào)報(bào)道。本文選用了一株株產(chǎn)氫光合細(xì)細(xì)菌Rhoddopseuudomonnsaaciidophiila，比較較了幾種常用用的不同的EPS提取方法的的提取效率?；诒容^結(jié)果果，選擇EDTA作為為提取方法，進(jìn)進(jìn)一步研究提提取時(shí)間和提提取劑用量的的對(duì)EPS提取的影響。而而且，對(duì)EPS的UV-Viis和紅外光譜譜特性也進(jìn)行行的簡(jiǎn)單的研研究，并且提提出了一個(gè)簡(jiǎn)簡(jiǎn)單方便的方方法，用來(lái)判判斷提取過(guò)程程中的細(xì)胞破破壞程度。1．材料與方法法1.1光合細(xì)細(xì)菌R.aciddophilla,從中中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)學(xué)研究院東海海水產(chǎn)研究所所購(gòu)得。這株株光合細(xì)菌能能夠利用乙酸酸、丙酸、丁丁酸產(chǎn)氫。在在4000Lux，30oC下，當(dāng)?shù)孜镂餅?.8gg/l乙酸、1.0gg/l丙酸、0.4gg/l丁酸的混和和酸時(shí)，在208小時(shí)以?xún)?nèi)，該該P(yáng)SB能夠產(chǎn)生494mml氫氣，最大大產(chǎn)氫速率為為21.9ml/l//h。生長(zhǎng)培養(yǎng)基成成分為(每升)：KH2PO40.5g,K22HPO40.6g,NaaCl0..4g,MgSO44?7H2O0.22g,CCaCl2?2H2O0.005g,(NH4)2SO41.255g,琥珀酸鈉9.8g，1ml微量元素溶溶液。培養(yǎng)基基的pH為7.0，培養(yǎng)溫度32oC，光照強(qiáng)度3000Lux，充氬氣保保持厭氧環(huán)境境。1.2EPSS的提取方法法采用五種方法從從R.accidophhila提取EPS，即EDTA、NaOH、H2SO4、熱處理和和高速離心。分分別取40mllPSB培養(yǎng)液，120000rpm，4oC離心10miin，菌體用0.9%NaCl溶液洗滌兩兩次，然后重重懸于10mll二蒸水中，再再分別加入一一定量的EDTA(2%)、NaOH(1N)、H2SO4(8%))溶液，4oC放置提取3h。為了比較較，另取兩份份，分別采用用熱提取(70oC，1h)和高速離心心方法提取EPS。然后，將將細(xì)菌EPS溶液經(jīng)4oC120000rpmm離心15miin，除去剩余余的細(xì)菌，上上清液為EPS溶液。因EDTA干擾蛋白的的測(cè)定，將EDTA提取的EPS溶液對(duì)二蒸蒸水透析過(guò)夜夜。最后，將將所得的EPS溶液經(jīng)0.45μm醋酸纖維素素膜過(guò)濾，再再進(jìn)行成分分分析。1.3分析方方法多糖用蒽酮法測(cè)測(cè)定，蛋白用用Lowry法測(cè)定，核核酸含量用紫紫外吸收法測(cè)測(cè)定。Ca2+和Mg2+用原子吸吸收法測(cè)定(WFx-1120，Rayleeigh分析儀器公公司)。為了測(cè)定EPSS的紅外光譜譜，將兩倍預(yù)預(yù)冷乙醇加入入EPS溶液中，沉沉淀重懸于雙雙蒸水中，透透析過(guò)夜，再再用乙醇沉淀淀，沉淀物用用乙醇洗滌兩兩次，最后真真空干燥。干干燥的沉淀物物用于IR分析(VECTTOR222,Bruuker公司)。UV－Vis光光譜用島津UV-24401PC儀器分析。2.結(jié)果與討討論：2.1提取方方法的比較不同提取方法的的比較結(jié)果列列于表1。結(jié)果表明，提取出的EPS量和提取方方法有很大關(guān)關(guān)系，其中，NaOH法，提取的EPS最多，熱處處理和EDTA法次之，H2SO4法和高速離離心最少。一一個(gè)好的提取取方法，不但但提取效率要要高，而且對(duì)對(duì)細(xì)胞的破壞壞要少，一般般核酸的含量量用來(lái)評(píng)價(jià)提提取過(guò)程中細(xì)細(xì)胞破壞程度度[7]。上述五種種提取方法中中，提取的EPS溶液中核酸酸含量大小順順序?yàn)椋篘aOH>熱提取>EDDTA>H2SO4>離心。用NaOH提取EPS，核酸的含含量是用離心心法的9.6倍，說(shuō)明提提取過(guò)程中細(xì)細(xì)胞破壞嚴(yán)重重，大量提取取出來(lái)的EPS其實(shí)是胞內(nèi)內(nèi)物質(zhì)。同樣樣，熱提取的的EPS中，核酸含含量也很高。EDTA法、硫酸法法和離心法對(duì)對(duì)細(xì)胞破壞少少，但是硫酸酸法和離心法法提取的EPS量很少，提提取效率低，不不是一種有效效的提取方法法。結(jié)果表明明，EDTA的提取效率率高，對(duì)細(xì)胞胞的破壞少，是一種從R.acidophila中提取EPS的有效方法，比其他幾種方法要優(yōu)越。用EDTA提取的EPS中多糖，蛋白、核酸的含量分別為6.5,58.4和5.4mg/g干重。在以后的實(shí)驗(yàn)中，都采用EDTA法來(lái)提取EPS。從表中還可以看出，用不同的提取方法，提取的EPS量在12.9~159.2mg/g干重中變動(dòng)，同樣多糖蛋白比值在0.06~1.71范圍內(nèi)。由上述討論可知，EPS的提取方法和操作步驟同時(shí)影響提取的EPS的成分和含量。表1.不同方方法從R.aacidopphila中中提取的EPS的含量(mg/g干重)與多糖/蛋白比EDTANaOHH2SO4熱提取高速離心多糖6.57.710.610.34.1蛋白58.4126.66.237.76.2核酸5.424.94.623.62.6總EPS70.3159.221.471.612.9多糖/蛋白0.110.061.710.270.66從R.aciidophiila中提取取的EPS中，蛋白的的含量和Watannabe等人[2]從海水中分分離的Rhoodovullumspp.的EPS中蛋白含量量基本相同，但但是多糖和核核酸的含量卻卻小于Rhoodovullumspp.的EPS中的，Rhoodovullumspp.的EPS中多糖/蛋白約為0.6，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于R.accidophhilaEEPS中的多糖/蛋白0.11。由于Rhoodovullumspp.具有良好的的絮凝性能，而而R.aciidophiila絮凝性性能相對(duì)較差差，EPS的含量和物物質(zhì)成分的差差別可能也是是一部分原因因，Watannabe等認(rèn)為胞外外核酸在細(xì)菌菌的絮凝性能能中起主導(dǎo)作作用。2.2提取時(shí)時(shí)間和提取劑劑用量的影響響從圖1和2可以以看出，EPS中蛋白含量量受提取時(shí)間間和提取劑用用量影響很大大，而多糖和和核酸幾乎不不受影響。當(dāng)當(dāng)提取時(shí)間超超過(guò)1h，EPS的含量基本本保持不變，維維持在48.4，7.5和7.3mmg/g干重左右。EDTA的提取速度度快，可能是是由于EDTA和二價(jià)離子子的絡(luò)合反應(yīng)應(yīng)速度很快。從從圖2(A)中可以得出出，當(dāng)EDTA的用量從0.8增加到2.8gg/g干重時(shí)，EPS的量也從29.9迅速增加到84.3mg/g干重，然而而當(dāng)EDTA用量繼續(xù)增增加時(shí)，提取取的EPS的量基本保持不不變。這和細(xì)細(xì)菌培養(yǎng)液中中多價(jià)離子含含量有限有關(guān)關(guān)，當(dāng)多價(jià)離子都都被EDTA絡(luò)合后，再再增加EDTA的量，將不不會(huì)顯著的提提高EPS的提取效率率。從圖2(B)中可以看出出，Ca2+和Mg2+的含量隨著EDTA的用量增加加而增加，到到2.8gg/g干重之后，這這些二價(jià)離子子的濃度都基基本上保持不不變或略有降降低。這些二二價(jià)離子的濃濃度和蛋白的的濃度有一定定的相關(guān)性，EPS中Ca2+和Mg2+的含量增高高，蛋白的含含量也增大，說(shuō)說(shuō)明在細(xì)菌EPS中，這些二二價(jià)離子是主主要和蛋白結(jié)結(jié)合的，因?yàn)闉樵谥行詶l件件下，蛋白質(zhì)質(zhì)的羧基會(huì)離離解而帶負(fù)電電，然后就靠靠這些二價(jià)離離子通過(guò)離子子橋接把EPS和細(xì)菌結(jié)合合在一起。當(dāng)當(dāng)EDTA除去去這些離子時(shí)時(shí)，EPS也就隨之釋釋放到溶液中中去了。圖1.提取時(shí)間間對(duì)EPS量的影響圖2.提取劑劑用量的影響響：(A)EPS量；(B)Caa2+和Mg2+含量EPS中三種主主要物質(zhì)的提提取難易程度度也有所不同同，從圖2可以看出，用用EDTA提取，多糖糖和核酸比較較容易提取，在在少量的EDTA存在下，較短的時(shí)間就就能提取比較較完全，而蛋蛋白比較難提提取，很大的的EDTA劑量才能提提取比較完全全。這說(shuō)明，提提取的操作也也同時(shí)影響著著提取的EPS的量和成分分。2.3EPSS紅外光譜圖3是從R.aacidopphila中中提取的EPS的紅外光譜譜圖。譜圖中中有五個(gè)很明明顯的峰：3422，2923，1635，1395，1055cm-1，其中3422處峰是OH伸展振動(dòng)產(chǎn)產(chǎn)生的，2923處的較弱的的峰是C－H振動(dòng)峰，而1635和1395處是羧基中C=O不對(duì)稱(chēng)和對(duì)對(duì)稱(chēng)伸展振動(dòng)動(dòng)峰。處于1000~~1200處的吸收峰峰一般為糖衍衍生物的典型型吸收峰。從從紅外光譜譜譜圖中，我們們可以知道，EPS中含有的最最主要的活性性基團(tuán)是羧基基和羥基。2.4UV－－Vis光譜圖3.R.acidoophilaa的EPS的紅外光譜譜圖4.A：EEPS提取前后R.aciddophilla溶液UV-Viis光譜；B：EDTA和NaOH提取的EPSUUV－Vis光譜圖4(A)為PPSB提取前和經(jīng)EDTA和NaOH提取后的UV-Viis光譜圖，圖圖4(B)為從PSB中提取的EPS的Uv-Viis譜圖。從圖圖4(A)可以看到細(xì)細(xì)胞色素的幾幾個(gè)典型吸收收峰，590，800，860nnm，如果在提提取過(guò)程中細(xì)細(xì)胞被破壞，胞胞內(nèi)物質(zhì)泄漏漏出來(lái)，則提提取前后細(xì)胞胞的吸收峰強(qiáng)強(qiáng)度在譜圖上上就應(yīng)該可以以看出發(fā)生了了改變，而且且在EPS譜圖上應(yīng)該該也可以觀察察到類(lèi)似的吸吸收峰，因而而，可以利用用UV－Vis譜圖來(lái)判斷斷提取過(guò)程對(duì)對(duì)細(xì)胞的破壞壞程度。從圖圖上可以看出出，EDTA提取前后細(xì)細(xì)胞色素峰的的強(qiáng)度幾乎沒(méi)沒(méi)有改變，EDTA提取的EPS的UV-Viis譜圖上也沒(méi)沒(méi)有色素峰的的出現(xiàn)；而經(jīng)經(jīng)過(guò)NaOH提取，細(xì)胞胞懸浮液的峰峰強(qiáng)度明顯減減弱，甚至消消失，而在NaOH提取的EPS譜圖上，液液可以看到有有色素峰的出出現(xiàn)。這個(gè)現(xiàn)現(xiàn)象說(shuō)明，EDTA提取方法對(duì)對(duì)細(xì)胞破壞少少，而NaOH方法細(xì)胞破破壞卻很?chē)?yán)重重，這個(gè)結(jié)果也和前前述核酸數(shù)據(jù)據(jù)相符。細(xì)胞胞破壞程度是是判斷一種提提取方法是否否恰當(dāng)?shù)囊粋€(gè)個(gè)重要指標(biāo)，很很難估計(jì)，缺缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)判斷方法。以前一般用蛋白或者核酸的含量來(lái)判斷，但是EPS本身中也含有大量的蛋白和核酸，所有這種方法并不是很恰當(dāng)，后來(lái)有用ATP或葡萄糖－6－磷酸脫氫酶這些胞內(nèi)物質(zhì)的含量來(lái)判斷[7]，可是這些物質(zhì)的測(cè)量方法都很費(fèi)時(shí)費(fèi)事，使用中受限。UV－Vis作為一種快速方便的方法，可以用來(lái)評(píng)價(jià)EPS提取過(guò)程中的細(xì)胞破壞程度。3.結(jié)論：從R.aciidophiilaEPS的提取方法法比較來(lái)看，EDTA法的提取效率高，對(duì)細(xì)胞的的破壞程度小小，是一種較好好的提取EPS的方法。用EDTA法提取的EPS量為70.3mg/g干重。EDTA的適宜提取時(shí)間間約為1～3h，提取劑量量約為2.8ggEDTAA/g干重。提取取方法，提取取時(shí)間和提取取劑的用量都都會(huì)影響提取取的EPS的量和成分分。同樣，從從EPS和細(xì)菌的UV－Vis數(shù)據(jù)中同樣樣可以看出，EDTA對(duì)細(xì)胞的破破壞較小，而而NaOH破壞很大。提提取過(guò)程中細(xì)細(xì)胞的破壞程程度是判斷一一種提取方法法優(yōu)劣的一個(gè)個(gè)重要指標(biāo)，但目前缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)判斷方法，UV－Vis法作用一種方便快速的方法，有可能用來(lái)判斷EPS提取過(guò)程中細(xì)胞的破壞程度。參考文獻(xiàn)[1]EroogluII,AsllanK,,GundduzU,,YuceelM,TurkeerL.SubsttrateconsuumptioonrattesfoorhyddrogennprodductioonbyRhodoobacteersphhaeroiidesiinaccolumnnphottobiorreactoor.JBioteechnoll,19999,700:103--113[2]WattanabeeM,SSasakiiK,NNakashhimadaaY,KKakizoonoT,,NopaaratnaaraporrnN,NishiioN.GrowtthanddfloccculattionoofammarineephottosynttheticcbactteriummRhoddovuluumsp..AppllMicrrobiollBiottechnool,19998,550:6822-691[3]MorrganJJW,FoorsterrCF,EvisoonL.Acommparattivesstudyofthhenattureoofbioopolymmerseextracctedffromaanaeroobicaandacctivattedslludgess.WattRes,,