移植PlGF基因轉(zhuǎn)染的hMSCs對于大鼠梗塞心肌血管的新生作用,病理學(xué)論文

移植PlGF基因轉(zhuǎn)染的hMSCs對于大鼠梗塞心肌血管的新生作用,病理學(xué)論文干細胞移植治療心肌缺血能夠促進梗塞心肌的血管增生、減少心肌梗塞的面積，改善心肌功能。被移植的干細胞進入心肌缺血體內(nèi)，到達缺血部位后，能夠通過變形、游走方式進入缺血組織，在缺血缺氧環(huán)境下分化成血管內(nèi)皮細胞。干細胞同時能夠分泌各種血管因子，如Angiopoitine-1,(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF〕等，華而不實還包括胎盤生長因子(Placentalgrowthfactor,PlGF)。PlGF因子是家族中的一員，PlGF已經(jīng)被證實在大腦、下肢缺血動物模型中具有促進新的血管生成，改善局部循環(huán)的血流狀態(tài)的作用。本實驗中，在心肌缺血發(fā)生后一周后，靜脈移植人間充質(zhì)干細胞〔humanmesenchymalstemcells,hMSCs〕及PlGF基因修飾的hMSCs〔PlGF-hMSCs〕，并在移植后一個月觀察大鼠心肌PlGF蛋白表示出水平以及血管增生情況。在本實驗中，hMSCs和PIGF高分泌功能的PlGF-hMSCs，在心肌缺血的一周后給與靜脈注射移植，并在移植后的一周、一個月觀察大鼠心肌PlGF蛋白表示出水平以及血管增生情況。1、材料和方式方法1.1干細胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染將健康人志愿者的間充質(zhì)干細胞放入10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃，5%的CO2孵箱培養(yǎng)。本實驗采用腺病毒進行轉(zhuǎn)染，即hMSCs根據(jù)2106濃度接種于10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，與預(yù)先制成的AxCAhPlGF-F/RGD或AxCALacZ-F/RGD腺病毒質(zhì)?；旌?0分鐘進行轉(zhuǎn)染，細胞感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)為3103。使用DMEM清洗后常規(guī)保存24小時，準備移植使用。細胞移植之前離心收集。1.2大鼠心肌缺血模型選取體重280-320g雄性SpragueDawley大鼠,氯胺酮50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定于手術(shù)臺，氣管插管，行呼吸機支持。開胸，打開心包暴露心臟，找出冠狀動脈左前降支，結(jié)扎左前降支根部，逐層關(guān)閉胸腔。60min后松開活結(jié)，使冠狀動脈血流再通。隨機分為3組:對照組(DMEM組)6只;hMSCs移植組6只；PIGF-hMSCs組6只。動物用戊巴比妥(30mg/kg)腹腔麻醉，行左側(cè)開胸術(shù)暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支。關(guān)胸后放回籠中飼養(yǎng)。術(shù)后一周后使用股靜脈注射方式方法靜脈移植。每只大鼠經(jīng)靜脈移植hMSCs數(shù)目為2106。1.3PIGF蛋白測試體外轉(zhuǎn)染hMSCs48小時后，離心提取上清液。使用PlGFELISA(enzyme-linked、immunosorbent、assay)試劑盒(RDSystemsInc.,Minneapolis,USA)進行測試。1.4心肌梗塞體積測定心肌梗死后一月取出大鼠心臟。生理鹽水洗洗凈，放置-20℃凍存2min，從心尖至心底橫切成1mm厚的心室組織切片。將切片置于1%TTC(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride)溶液中，在37℃條件下進行染色。則非心肌梗死區(qū)染色為紅色，梗死區(qū)不染色。數(shù)字成像后，接入電腦圖像分析系統(tǒng)測定左室及梗塞區(qū)面積與正常側(cè)的面積百分比。1.5觀察測定血管新生移植后一個月，全麻狀態(tài)下靜脈注射異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖〔FITCdextran〕〔Sigma〕1ml，然后將大鼠開胸取出心臟，浸入4%福爾馬林4℃保存48小時。制成100m厚切片，在共聚焦顯微鏡〔LSMPascal;Carl、Zeiss〕20倍物鏡下觀察心肌缺血的交界處。掃描視野為512512像素〔651.5m651.5m〕,掃描厚度2.4m，并使用ZeissLSM軟件計算出毛細血管體積，每個層面取五個視野計算平均值。最后用患側(cè)毛細血管體積與健側(cè)一樣位置毛細血管體積相比，得出數(shù)值進行分析。1.6免疫染色觀察PlGF-hMSCs在發(fā)生梗塞的心肌能否分化成血管內(nèi)皮細胞，在大鼠心肌梗塞1周后靜脈移植LacZ標識的PlGF-hMSCs。移植后一個月，取出大鼠心臟，用4%福爾馬林浸泡24小時后冷凍。切成10m后的切片。雙重染色法染色。使用的抗體包括-galactosidase(rhodamine-labelledpolyclonalrabbitanti-b-galactosidaseanti-body,DAKO)和抗體[FITC-labelledpolyclonalrabbitanti-vonWill-brandFactor(vWF),DAKO]。圖片合成由Zeiss軟件完成。觀察使用共聚焦顯微鏡觀察LacZ轉(zhuǎn)染的PlGF-hMSCs在缺血心肌的分布情況。統(tǒng)計分析統(tǒng)計每組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以平均值標準差的形式表示，實驗組間的數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析比擬，P值0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2、結(jié)果PlGF在各組的invitro值，在MOI分別為300,1000,3000的條件下，PlGF測得Lacz-hMSCs組依次為0.050.02；0.070.03；0.150.08ng/105cell/48hr；PlGF-hMSCs組的PlGF蛋白表示出量依次為：1.450.17；2.140.35；5.120.72ng/105cell/48hr。PlGF-hMSCs組的PlGF蛋白表示出量明顯高于LacZ-hMSCs對照組，并且MOI在3000時，PlGF蛋白表示出量為最高〔表1〕。大鼠心肌梗塞一周，靜脈移植后一個月后心肌梗塞體積與健側(cè)的百分比，DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各組〔n=6〕分別為49.504.50%；41.732.05%；33.023.71%。據(jù)以上結(jié)果能夠看出，hMSCs以及PlGF-hMSCs移植后，心肌梗塞體積縮小，并且PlGF-hMSCs縮小得愈加明顯。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義〔p0.05〕〔表2〕。大鼠心肌梗塞一周，靜脈移植后一個月后得出患側(cè)與健側(cè)的毛細血管比值。DMEM、hMSCs、PlGF-hMSCs各組的比值分別為0.20.05；0.690.093；1.450.47。hMSCs及PlGF-hMSCs移植后，梗塞邊界處毛細血管新生明顯，PlGF-hMSCs組的毛細血管新生更為明顯。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義〔p0.05〕〔表3〕。大鼠心肌梗塞一周，經(jīng)靜脈移植LacZ-hMSCs細胞，一個月后對心肌切片進行雙重免疫染色。可見移植的hMSCs分化成為血管內(nèi)皮細胞〔圖1〕。討論通過以上實驗，我們證實了在心肌梗塞的亞急性期〔一周〕，經(jīng)靜脈移植hMSCs及PlGF-hMSCs后，能夠提高梗塞區(qū)域的PlGF表示出，促進血管新生，縮小心肌梗塞體積。以往的相關(guān)實驗證實了留神肌或下肢缺血后給予PlGF因子能夠促進產(chǎn)生母血管，而后再逐步構(gòu)成穩(wěn)定的、增大的成熟血管。具有這樣特征的血管的功能能夠持續(xù)保存至少一年，或者更長的時間。而PlGF與同類血管增生因子如VEGF、Ang-1相比，有著能夠避免組織水腫、纖維素沉積以及新生血管穩(wěn)定性差的情況。盡管國內(nèi)外有很多關(guān)于各種因子轉(zhuǎn)染干細胞移植治療心肌梗塞的報道，但是使用PlGF因子轉(zhuǎn)染干細胞治療心肌梗塞尚屬初次。有關(guān)研究報道了PlGF在缺血組織的過量表示出，提示了PlGF因子有可能在治療組織缺血方面起著重要的作用。而本實驗結(jié)果也證實了我們的假設(shè)。我們選擇了亞急性期進行移植，在梗塞缺血發(fā)生的急性期，毛細血管構(gòu)造仍然完好，而到了亞急性期，缺血區(qū)域的毛細血管壁會出現(xiàn)通透性增加，這樣干細胞攜帶PlGF會有更多時機進入缺血區(qū)域，進而發(fā)揮更大的治療作用。同時還考慮到在實際臨床治療中，患者在急性期發(fā)病一般需要采取參與支架治療或溶栓等治療。所以將來細胞移植成為一種臨床治療手段時，在患者心梗發(fā)生的亞急性期可能有更大的使用空間。我們有充分的理由等待PlGF基因轉(zhuǎn)染干細胞在將來的心肌梗塞的治療中發(fā)揮重要的作用。以下為參考文獻：1.劉改珍,肖傳實.干細胞在心肌梗死治療中的研究進展.中國分子心臟病學(xué)雜志,2006,6(6):359-362.2.KinnairdT,StabileE,BurnettMS,etal.Localdeliveryofmarrow-derivedstromalcellsaugmentscollateralperfusionthroughparacrinemechanisms.Circulation,2004,109(12):1543-1549.3.MaglioneD,GuerrieroV,VigliettoG,etal.IsolationofahumanplacentacDNAcodingforaproteinrelatedtothevascularpermeabilityfactor.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1991,88(20):9267-9271.4.LiuH,HonmouO,HaradaK,etal.NeuroprotectionbyPlGFgene-modifiedhumanmesenchymalstemcellsaftercerebralischaemia.Brain,2006,129(10):2734-2745.5.LuttunA,TjwaM,MoonsL,etal.RevascularizationofischemictissuesbyPlGFtreatment,andinhibitionoftumorangiogenesis,arthritisandatherosclerosisbyanti-Flt1.Naturemedicine,2002,8(8):831-840.6.AutieroM,LuttunA,TjwaM,etal.Placentalgrowthfactoranditsreceptor,vascularendothelialgrowthfactorreceptor,1:noveltargetsforstimulationofischemictissuerevascularizationandinhibitionofangiogenicandinflammatorydisorders.JournalofThrombosisandHaemostasis,2003,1(7):1356-1370.7.陳學(xué)穎,孫愛軍,弭守玲,等.辛伐他汀保衛(wèi)缺血-再灌注損悲傷肌的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究.中國分子心臟病學(xué)雜志,2018,10(6):360-365.8.LuttunA,TjwaM,CarmelietP.PlacentalGrowthFactor(PlGF)andItsReceptorFlt-1(VEGFR-1).AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2002,979(1):80-93.9.CarmelietP,MoonsL,LuttunA,etal.Synergismbetweenvascularendothelialgrowthfactorandplacentalgrowthfactorcontributestoangiogenesisandplasmaextravasationinpathologicalconditions.Naturemedicine,2001,7(5):575-583.10.DvorakHF,DvorakAM,ManseauEJ,etal.Fibringelinvestmentassociatedwithline1andline10solidtumorgrowth,angiogenesis,andfibroplasiainguineapigs.Roleofcellularimmunity,myofibroblasts,microvasculardamage,andinfarctioninline1tumorregression.JournaloftheNationalCancerInstitute,1979,62(6):1459-1472.11.PetterssonA,NagyJA,BrownLF,etal.Heterogeneityoftheangiogenicresponseinducedindifferentnormaladulttissuesbyvascularpermeabilityfactor/vascularendothelialgrowthfactor.Labora