第三章分子雜交與印跡技術(shù)詳解演示文稿

第三章分子雜交與印跡技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共60頁。優(yōu)選第三章分子雜交與印跡技術(shù)當(dāng)前2頁，總共60頁。2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。當(dāng)前3頁，總共60頁。3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加當(dāng)前4頁，總共60頁。4、DNA變性曲線

AT區(qū)先解鏈

GC區(qū)后解鏈階梯式曲線當(dāng)前5頁，總共60頁。5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3融解溫度：

定義：在DNA熱變性時，其A260的升高達(dá)最大值一半時的溫度。當(dāng)前6頁，總共60頁。（二）復(fù)性

1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。當(dāng)前7頁，總共60頁。2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子當(dāng)前8頁，總共60頁。3、復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動力學(xué)）dCdt=K2C2（1）將（1）積分CCo11+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時，（2）式中的為121211+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=當(dāng)前9頁，總共60頁。二、分子雜交將任何具有互補(bǔ)核苷酸順序的兩條單鏈核酸分子放入同一個反應(yīng)體系，兩條互補(bǔ)鏈可通過復(fù)性重新締合形成雙鏈，這一過程成為核酸分子雜交。當(dāng)前10頁，總共60頁。三、探針

（一）探針的種類

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針探針：是指帶有標(biāo)記物的、能與被檢測的核酸片段互補(bǔ)的一段已知核酸片段。當(dāng)前11頁，總共60頁。（二）探針的制備方法制備方法：(1)DNA重組技術(shù)(2)PCR擴(kuò)增(3)化學(xué)合成當(dāng)前12頁，總共60頁。合成寡核苷酸探針注意原則(1)長度（50-300bp);(2)G:C對含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個以上堿基序列相同，最好不用。當(dāng)前13頁，總共60頁。（三）標(biāo)記物

1.想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性當(dāng)前14頁，總共60頁。2.標(biāo)記物種類

核素標(biāo)記物：32p、35s、3H

非核素標(biāo)記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

當(dāng)前15頁，總共60頁。（四）標(biāo)記方法

體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

當(dāng)前16頁，總共60頁。體外標(biāo)記法：化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上當(dāng)前17頁，總共60頁。酶促標(biāo)記法1.切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中當(dāng)前18頁，總共60頁。當(dāng)前19頁，總共60頁。2.隨機(jī)引物法

其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的DNA鏈。合成時，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中當(dāng)前20頁，總共60頁。當(dāng)前21頁，總共60頁。隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點：1、能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上4、可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記當(dāng)前22頁，總共60頁。3.PCR標(biāo)記法：將標(biāo)記的核苷酸作為PCR反應(yīng)的底物，以待標(biāo)記的DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中當(dāng)前23頁，總共60頁。當(dāng)前24頁，總共60頁。

三、影響雜交的因素

1、探針分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率當(dāng)前25頁，總共60頁。2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低

Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃當(dāng)前26頁，總共60頁。3、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

當(dāng)前27頁，總共60頁。4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交

當(dāng)前28頁，總共60頁。5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）復(fù)性速率與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成反比（3）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復(fù)雜性當(dāng)前29頁，總共60頁。6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

當(dāng)前30頁，總共60頁。

四、應(yīng)用1.檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；2.用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。當(dāng)前31頁，總共60頁。按待測核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相雜交印跡雜交原位雜交液相雜交按照雜交分子特性分DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交蛋白質(zhì)雜交第二節(jié)核酸分子雜交的方法當(dāng)前32頁，總共60頁。一、Southern印跡雜交此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。當(dāng)前33頁，總共60頁。帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程當(dāng)前34頁，總共60頁。（一）待測核酸樣品的制備

1、裂解或破碎細(xì)胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段當(dāng)前35頁，總共60頁。（二）待測DNA樣品的電泳分離

1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠

2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶

3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

當(dāng)前36頁，總共60頁。（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

當(dāng)前37頁，總共60頁。（四）Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程當(dāng)前38頁，總共60頁。1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能

非特異吸附少當(dāng)前39頁，總共60頁。（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強(qiáng)，雜交信號本底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點：雜交信號本底高③化學(xué)活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能力較上述兩種膜低當(dāng)前40頁，總共60頁。2、Southern印跡的常用方法（1）毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上當(dāng)前41頁，總共60頁。。當(dāng)前42頁，總共60頁。（2）電轉(zhuǎn)法利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。當(dāng)前43頁，總共60頁。當(dāng)前44頁，總共60頁。（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。當(dāng)前45頁，總共60頁。當(dāng)前46頁，總共60頁。

（五）Southern雜交

1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液

2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的

DNA

當(dāng)前47頁，總共60頁。（六）雜交結(jié)果檢測

1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針

2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標(biāo)記的探針當(dāng)前48頁，總共60頁。（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長度多態(tài)性的分析當(dāng)前49頁，總共60頁。二、Northern印跡雜交

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測樣品為總RNA或mRNA當(dāng)前50頁，總共60頁。Northern印跡與Southern印跡的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA當(dāng)前51頁，總共60頁。三、Western印跡雜交

將待檢測蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。當(dāng)前52頁，總共60頁。四、斑點及狹縫印跡雜交

1、斑點印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量當(dāng)前53頁，總共60頁。五、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交；根據(jù)雜交