抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用第一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏本章提要抗體的制備與應(yīng)用抗血清的制備單克隆抗體的制備基因工程抗體催化性抗體單抗的醫(yī)學(xué)應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)常見免疫分析方法沉淀反應(yīng)凝集反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)免疫分析靈敏度本章小結(jié)課后思考題第二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.1.1抗血清的制備抗原的準(zhǔn)備免疫動(dòng)物動(dòng)物的選擇免疫途徑免疫劑量與周期動(dòng)物采血法抗血清的純化與保存抗血清的鑒定第三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗血清與多克隆抗體抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可獲得含有特異性抗體的血清，稱為抗血清。多克隆抗體(polyclonalantibody)：抗血清中抗體是多個(gè)抗原決定簇刺激不同B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，所以稱為多克隆抗體。第四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗原的準(zhǔn)備半抗原與載體偶聯(lián)制備完全抗原常用的連接反應(yīng)及雙功能連接劑佐劑的使用：佐劑與抗原按1：1比例混合乳化連接基團(tuán)連接方法（連接劑）-NH2/-COOH碳二亞胺（EDC）法、混合酸酐（MA）法、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）法-NH2/-NH2戊二醛法、SPDP法-NH2/-OH高碘酸鈉法、琥珀酸酐法芳香胺基重氮化法-NH2/-SHMBS法、SMPT法、SMBT法第五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏動(dòng)物的選擇抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好。對(duì)蛋白質(zhì)抗原，大部分動(dòng)物皆適合常用的是山羊和家兔；甾體激素免疫多用家兔；酶類免疫多用豚鼠?？寡辶康男枰捍髣?dòng)物如馬、騾等可獲得大量血清（一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清）；但有時(shí)抗體需要是不多，選用家兔或豚鼠即可。第六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫途徑一般采用多點(diǎn)注射，一只動(dòng)物注射總數(shù)約為8~10點(diǎn)，包括足掌及肘窩淋巴結(jié)周圍，背部兩側(cè)、頜下、耳后等處皮內(nèi)或皮下，免疫效果較好；亦有肌肉、腹腔、靜脈注射途徑。腹腔、肌肉、皮內(nèi)、皮下注射適合使用任何抗原，刺激局部淋巴結(jié)發(fā)生免疫應(yīng)答；靜脈注射適合可溶性抗原及分散的單細(xì)胞懸液，不使用佐劑，免疫應(yīng)答主要發(fā)生在脾臟。第七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫劑量與周期免疫劑量：抗原用量視抗原種類及動(dòng)物而異，一般大動(dòng)物抗原劑量（以蛋白抗原為準(zhǔn)）約0.5~1mg/只，小動(dòng)物約0.1~0.6mg/只。免疫周期：初次免疫后，再經(jīng)2～3次以上的加強(qiáng)免疫，一般3～4周間隔適合大部分動(dòng)物，小動(dòng)物10～14天，大動(dòng)物2月左右。第八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏動(dòng)物采血法頸動(dòng)脈放血法：這是最常用的方法，對(duì)家兔、山羊等動(dòng)物皆可采用。心臟采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、雞等小動(dòng)物。此法采血技術(shù)應(yīng)熟練，穿刺不準(zhǔn)容易導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡。靜脈多次采血法：家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時(shí)可采集多量血液。第九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗血清的純化與保存試血、采血：加強(qiáng)免疫后2－3次，可通過耳靜脈或眼球采血，進(jìn)行抗血清效價(jià)測定，當(dāng)效價(jià)達(dá)到理想高度，可以心臟直接采血或動(dòng)脈放血。待血凝后用針筒或吸管吸取血清?？寡寮兓蝴}析、層析(離子交換、分子篩、親和層析)。保存：低溫凍存，凍干、加保護(hù)劑（疊氮化鈉NaN3或BSA）4℃保存。第十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗血清的鑒定效價(jià)鑒定：效價(jià)又稱滴度（titer），是表達(dá)抗血清中特異性抗體相對(duì)含量的一個(gè)半定量指標(biāo)，即在一定條件下結(jié)合一定量抗原的抗血清的稀釋度。親和力鑒定：親和力（affinity）指抗血清與相應(yīng)抗原結(jié)合的強(qiáng)度，是描述抗體特異性的重要指標(biāo)，常用親和常數(shù)K表示。抗體特異性鑒定：常用瓊脂雙擴(kuò)散法鑒定抗體特異性。第十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.1.2單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody，MAb）——由單一B細(xì)胞克隆合成并分泌的一種組成均一的免疫球蛋白分子，簡稱單抗。單抗制備的原理單抗制備的材料單抗制備的技術(shù)單抗制備流程圖第十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單抗制備的原理MAb是單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，其特異性是針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的，它是B細(xì)胞克隆的標(biāo)志。為使B細(xì)胞在體外能長期存活，Kǒhler和Milstein于1975年創(chuàng)建了雜交瘤方法。其基本原理是：將分泌抗體但不能長期培養(yǎng)的B細(xì)胞與能長期體外培養(yǎng)但不能分泌抗體的瘤細(xì)胞融合，篩選出既能分泌抗體又能長期體外培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞，然后單克隆化，并擴(kuò)大培養(yǎng)，從而進(jìn)行單抗生產(chǎn)。第十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單抗制備的材料骨髓瘤細(xì)胞：不產(chǎn)生抗體或產(chǎn)生抗體的某種鏈但不分泌次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型B細(xì)胞——小鼠或大鼠脾臟融合劑——50%的聚乙二醇（PEG）或電脈沖HAT選擇培養(yǎng)基——含10%-20%小牛血清和HAT的RPMI1640）第十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單抗制備的技術(shù)抗原提純與動(dòng)物免疫骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備細(xì)胞融合HAT法篩選雜交瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞的篩選、單克隆化與保存單克隆抗體的制備與純化第十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗原提純與動(dòng)物免疫抗原純度越高越好，尤其是初次免疫抗原。選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c（巴比塞）健康小鼠，鼠齡在8~12周，雌雄不限，可同時(shí)免疫3~4只小鼠。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為最終目的，免疫間隔一般2~3周。末次免疫后3~4天，取出脾臟組織，制成單細(xì)胞懸液。第十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏骨髓瘤細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的制備選擇瘤細(xì)胞株應(yīng)用最多的是源自BALB/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞株，要求是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合時(shí)應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95％）。在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，需加入飼養(yǎng)細(xì)胞，常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠腹腔細(xì)胞，可用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出腹腔液即可，其中多為巨噬細(xì)胞。第十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏細(xì)胞融合細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，其基本步驟如下：骨髓瘤細(xì)胞與脾臟細(xì)胞混合（1:2～1:10）培養(yǎng)，培養(yǎng)液中小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分需嚴(yán)格配制，以保證融合效率；加入40％（W/V）PEG1000~2000使細(xì)胞融合；1min后滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml稀釋，消除PEG的作用。第十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏HAT法篩選雜交瘤細(xì)胞哺乳動(dòng)物DNA合成的兩條途徑：salvage

pathway替代合成途徑胸腺嘧啶（T）胸腺嘧啶激酶（TK）次黃嘌呤（H）次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）核苷酸染色體DNAdonovopathway從頭合成途徑磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶葉酸核苷酸氨基蝶呤（A）第十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏陽性細(xì)胞的篩選、單克隆化與保存篩選ELISA、Dot-ELISA、凝集試驗(yàn)、免疫印跡、免疫熒光試驗(yàn)單克隆化有限稀釋法熒光激活細(xì)胞分揀法（FACS）保存冰凍保存，溫度越低越好，研究顯示，液氮保存的細(xì)胞株活性僅有輕微下降。第二十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單克隆抗體的制備與純化篩選出陽性細(xì)胞株進(jìn)行抗體制備，有兩種方法：增量培養(yǎng)法：即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體，如大瓶培養(yǎng)法、中空反應(yīng)器法。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法：將雜交瘤細(xì)胞接種到弗氏佐劑處理的BALB/c小鼠腹腔中去，通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，抗體含量較高且雜蛋白較少，每只小鼠可收集5~10ml的腹水。單抗的純化方法與多抗相同。第二十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.1.3基因工程抗體基因工程抗體是利用DNA重組技術(shù)，在基因水平上對(duì)Ig分子進(jìn)行剪接、修飾，甚至是人工合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，而制備的一種新型抗體。根據(jù)基因工程抗體的結(jié)構(gòu)不同，可以分為：人－鼠嵌合抗體改型抗體雙特異性抗體小分子抗體基因工程抗體的結(jié)構(gòu)與特性第二十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏人－鼠嵌合抗體結(jié)構(gòu)：鼠源V區(qū)或Fab＋人源C區(qū)或Fc制備：從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人－鼠嵌合抗體。特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。第二十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏改型抗體結(jié)構(gòu)：將鼠單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，故又稱CDR移植抗體。特點(diǎn)：抗體CDR直接決定抗體的特異性，改型抗體使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)減少其異源性。第二十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏雙特異性抗體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：由異源性的H2＋L2構(gòu)成，具備結(jié)合兩種不同抗原的特點(diǎn)，又稱雙功能抗體。制備：將兩套輕鏈、重鏈基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞中，選擇合適的抗體恒定區(qū)及Ig類型表達(dá)。應(yīng)用：將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易殺傷腫瘤細(xì)胞。第二十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏小分子抗體源自抗體且保持抗原結(jié)合能力，但不具備完整抗體結(jié)構(gòu)的一系列小分子。典型的小分子抗體有：單鏈抗體scFv由VH－連接肽－VL組成，它質(zhì)量很小，作為異種蛋白抗原性較小，組織穿透力強(qiáng)，是目前研究最活躍的基因工程抗體之一，可用噬菌體轉(zhuǎn)染細(xì)菌大量制備。其他小分子抗體還有：Fab、Fv，單域抗體（VH），最小識(shí)別單元（CDR）等。第二十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏基因工程抗體的種類及其特性種類基本結(jié)構(gòu)相對(duì)分子質(zhì)量(kD)鼠源性成分人－鼠嵌合抗體鼠源V區(qū)/Fab＋人源C區(qū)/Fc15025%~30%改型抗體以鼠源CDR替換人源CDR15015%雙特異性抗體異源性H2/L215033％小分子抗體Fab完整L鏈和部分H鏈5015%FvVH非共價(jià)連接VL2515%單鏈抗體VH－連接肽－VL2615%單域抗體VH12.57.5%最小識(shí)別單元單一CDR﹤2﹤1.5%第二十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.1.4催化性抗體一種具有催化化學(xué)反應(yīng)活性的抗體，又稱抗體酶（abozyme），表現(xiàn)出對(duì)底物立體結(jié)構(gòu)的專一性，催化的化學(xué)反應(yīng)特異性高于酶，效率低于常規(guī)酶類。通過設(shè)計(jì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換態(tài)類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯(lián)后免疫動(dòng)物，可制備催化性抗體：先篩出與底物或半抗原結(jié)合的抗體，再從中篩出有催化活性的抗體；對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)修飾，使催化反應(yīng)的產(chǎn)物可直接表現(xiàn)抗體的催化活性。第二十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.1.5單抗的醫(yī)學(xué)應(yīng)用單克隆抗體的均一性和生物活性單一性，使抗原抗體反應(yīng)結(jié)果便于質(zhì)量控制，利于標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。目前已有許多檢驗(yàn)試劑盒用單抗制成，其主要用途如下：單克隆抗體具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，可用于各類病原體的診斷，這是單克隆抗體應(yīng)用最多的領(lǐng)域。對(duì)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行檢測，用于腫瘤的診斷、分型及定位。第二十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏檢測淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞分化階段。應(yīng)用單克隆抗體和免疫學(xué)技術(shù)，可對(duì)機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測定，以便判斷健康狀態(tài)、檢出疾病、指導(dǎo)診斷和治療等。鼠源性單抗作為體外診斷試劑是滿意的，但用于人體可能會(huì)引起過敏反應(yīng)甚至危及生命。目前雖然已通過人－鼠細(xì)胞雜交及人－人細(xì)胞雜交進(jìn)行了一些探索，但還不能商品化生產(chǎn)，因此制備人源單克隆抗體是目前亟待解決的問題。第三十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.2.1抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段：抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，此階段僅需幾秒至幾分鐘，不出現(xiàn)可見反應(yīng)?？梢姺磻?yīng)，此階段抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)集聚，表現(xiàn)為凝集、沉淀、中和、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)原理：抗原抗體間的作用力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第三十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗原抗體間的作用力抗原和抗體通過非共價(jià)鍵結(jié)合，兩者間涉及多種弱的分子間作用力：靜電引力、范德華力、氫鍵作用力、疏水作用力等?？乖贵w間結(jié)合力表現(xiàn)為：親和力（affinity）：單價(jià)抗原與抗體間結(jié)合力的強(qiáng)度，表現(xiàn)為抗原抗體反應(yīng)平衡常數(shù)；親合力（avidity）：多價(jià)抗原與抗體間結(jié)合力的總強(qiáng)度，表現(xiàn)為多個(gè)親和力的加成。第三十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏親水膠體轉(zhuǎn)換為疏水膠體親水膠體：抗體和大多數(shù)抗原都是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)親水的氨基羧基周圍可形成水化層，再加上同種電荷相斥，就形成了穩(wěn)定的親水膠體。疏水膠體：當(dāng)抗原與抗體結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變?。磺铱乖贵w結(jié)合后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。各疏水膠體進(jìn)一步靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物沉淀。第三十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.2.2抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)是指抗原與對(duì)應(yīng)抗體在一定條件下特異結(jié)合，形成可逆性抗原抗體復(fù)合物的過程。此類反應(yīng)的規(guī)律和特點(diǎn)有：特異性可逆性比例性第三十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏特異性特異性是指任何一種抗原分子，只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng)。因?yàn)榭贵wCDR與抗原決定簇在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系。這種高度的特異性在傳染病的診斷、防治等醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域都已得到了廣泛的應(yīng)用。大多數(shù)天然抗原物質(zhì)的構(gòu)成復(fù)雜，常含有多種抗原決定簇。如果兩種不同的抗原物質(zhì)具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，則可與彼此相應(yīng)的抗血清出現(xiàn)交叉反應(yīng)（crossreaction）。第三十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏可逆性可逆性是指在一定條件（如低pH、高濃度鹽等）下，抗原抗體復(fù)合物分子間作用力減弱而導(dǎo)致解離，回復(fù)到抗原與抗體的游離狀態(tài)?？乖贵w反應(yīng)遵循生物大分子熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng)原則，其反應(yīng)式為：抗原抗體反應(yīng)平衡取決于兩個(gè)因素，一是抗原抗體親合力大?。欢黔h(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響。第三十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏比例性比例性是指多價(jià)抗原與抗體反應(yīng)，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，才形成大的抗原抗體結(jié)合物，產(chǎn)生凝集、沉淀等可見反應(yīng)。把最迅速出現(xiàn)可見反應(yīng)時(shí)的抗原抗體的濃度比或量比，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)點(diǎn)（equivalencepoint），抗原與抗體比例最合適的范圍稱等價(jià)帶（equivalencezone）。Marrack提出的網(wǎng)格學(xué)說解釋了抗原抗體反應(yīng)比例性的機(jī)制。第三十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏網(wǎng)格學(xué)說當(dāng)多價(jià)抗原與多價(jià)抗體在等價(jià)帶結(jié)合時(shí)，相互交叉連接成具有立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)格狀復(fù)合體，形成肉眼可見的沉淀物。當(dāng)抗原或抗體過剩時(shí)，由于過剩方的結(jié)合價(jià)得不到飽和，只能形成較小復(fù)合物，不能出現(xiàn)可見反應(yīng)。第三十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.3.1沉淀反應(yīng)在體外當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體濃度比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，廣泛用于抗原或抗體的定性及定量分析。根據(jù)反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法不同，沉淀反應(yīng)可分為以下幾種類型：液相沉淀反應(yīng)凝膠擴(kuò)散沉淀免疫電泳試驗(yàn)免疫共沉淀第三十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏液相沉淀反應(yīng)指以含鹽緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)的抗原抗體特異性結(jié)合的沉淀試驗(yàn)，可分為3類：絮狀沉淀試驗(yàn)：抗原抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。環(huán)狀沉淀試驗(yàn)：將抗原溶液疊加在細(xì)小玻管中抗體溶液上面，在兩液交界的清晰界面上形成白色沉淀環(huán)。主要用于鑒定微量抗原如鑒定血跡，診斷炭疽。免疫濁度試驗(yàn)：根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后溶液濁度變化測定未知抗原或抗體濃度。第四十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏凝膠擴(kuò)散沉淀瓊脂或瓊脂糖凝膠內(nèi)部是一種大孔徑網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抗原和抗體在凝膠中可自由擴(kuò)散。當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體經(jīng)擴(kuò)散后在凝膠中相遇形成復(fù)合物，若兩者在相遇處比例適當(dāng)，則復(fù)合物的分子量增大，顆粒增大，因而不再繼續(xù)擴(kuò)散而產(chǎn)生沉淀，呈現(xiàn)出線狀或帶狀。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方式和特性可分為：免疫單擴(kuò)散試驗(yàn)免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)第四十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫單擴(kuò)散試驗(yàn)原理：定量抗體混勻在瓊脂凝膠中，加待測抗原溶液使其單獨(dú)在凝膠中擴(kuò)散，形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正比。技術(shù)要點(diǎn)：將抗體和0.9%瓊脂50-56℃混合制成平板；凝固后在其上打孔，加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品；37℃自由擴(kuò)散24-48小時(shí)，孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)，測定沉淀環(huán)直徑。第四十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)原理：將抗原和抗體溶液分別放在凝膠不同的對(duì)應(yīng)孔中，讓兩者均在凝膠中自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成可見的沉淀線，可檢測抗原或抗體的特異性。技術(shù)要點(diǎn)：在平板玻璃上傾注一均勻的瓊脂凝膠薄層；打制2~3mm的小孔，分別加入抗原或抗體；溫育1~2天，可出現(xiàn)不同沉淀線。第四十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫電泳試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物，有兩大優(yōu)點(diǎn)：大大加快了沉淀反應(yīng)的速度；將某些蛋白組分根據(jù)帶電荷的不同而分開，再與抗體反應(yīng)，從而使本法更為微量化，多樣化，使其應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。常用技術(shù)有以下幾種：血清免疫電泳（IEP）火箭免疫電泳（RIEP）對(duì)流免疫電泳（CIEP）第四十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏血清免疫電泳（IEP）步驟：電泳分離抗原；在抗體槽內(nèi)加入抗血清；擴(kuò)散形成肉眼可見的弧形沉淀線。應(yīng)用：已知抗血清，根據(jù)沉淀弧的數(shù)量，位置和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及性質(zhì)。固定抗原，根據(jù)沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清的差異，即血清組分的缺少或增加。第四十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏火箭免疫電泳（RIEP）一種通過電泳進(jìn)行加速的單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，由于其沉淀形似火箭，故稱為火箭免疫電泳。在混合有抗體的凝膠上做孔，加入抗原電泳，沿電泳方向隨著抗原量的減少，沉淀帶越來越窄，形成火箭型沉淀線，沉淀線高度與抗原量成正比，可定量檢測特定血清蛋白含量。第四十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏對(duì)流免疫電泳（CIEP）又稱電滲析，實(shí)質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙向擴(kuò)散技術(shù)的結(jié)合。原理：在PH8.6的瓊脂凝膠中，抗體帶微弱的負(fù)電且較大，電泳力小于電滲力，泳向負(fù)極；而一般抗原電泳力大于電滲力，泳向正極。電泳時(shí)抗原放負(fù)極側(cè)孔，抗體放正極側(cè)孔，抗原抗體相對(duì)泳動(dòng)在兩孔間相遇，比例合適時(shí)形成沉淀線。有微量快速特點(diǎn)，常用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。第四十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫共沉淀以抗原和抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)互作的一種免疫學(xué)方法。原理與應(yīng)用：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)間互作會(huì)被保留。如果用某蛋白的抗體免疫沉淀，與該蛋白在胞內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)也會(huì)隨之沉淀。常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在胞內(nèi)結(jié)合，也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)新的作用搭檔。第四十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.3.2凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)（agglutination）是指顆粒性抗原或表面覆蓋抗原（或抗體）的顆粒狀載體，與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在一定條件下，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊現(xiàn)象。根據(jù)技術(shù)方法差異，凝集反應(yīng)可分為：直接凝集試驗(yàn)間接凝集試驗(yàn)抗球蛋白試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn)冷凝集試驗(yàn)第四十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏直接凝集試驗(yàn)細(xì)胞等顆粒性抗原在有電解質(zhì)的參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。凝集原：凝集反應(yīng)中的抗原凝集素：凝集反應(yīng)中的抗體常用的直接凝集試驗(yàn)有玻片法（定性）和試管法（定量）。第五十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏間接凝集試驗(yàn)用人工方法將可溶性抗原（或抗體）吸附或偶聯(lián)于載體上，使之成為致敏載體顆粒，在電解質(zhì)參與下與相應(yīng)抗體（或抗原）作用產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。載體：試驗(yàn)體系中與免疫無關(guān)的顆粒。致敏：抗原或抗體偶聯(lián)于載體表面的過程。致敏顆粒：吸附有已知抗原或抗體的顆粒。根據(jù)致敏用的試劑和反應(yīng)方式可分為：（正向）間接凝集試驗(yàn)反向間接凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)第五十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏用特異性抗原致敏載體，檢測樣本中的相應(yīng)抗體，如病菌感染產(chǎn)生的抗體，自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)患者抗體等。正向間接凝集反應(yīng)第五十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏載體，檢測樣本中的相應(yīng)抗原，可檢測HBsAg、細(xì)菌莢膜抗原等。第五十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏間接凝集抑制試驗(yàn)（陽性）用抗原致敏載體及相應(yīng)抗體作為診斷試劑，用于檢測樣本中是否存在與致敏顆粒相同的抗原，不出現(xiàn)凝集顆粒表示陽性。第五十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏間接凝集抑制試驗(yàn)（陰性）有凝集顆粒出現(xiàn)表示陰性——待測樣本中不存在與致敏顆粒相同抗原。妊娠檢測試驗(yàn)第五十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗球蛋白試驗(yàn)原理：機(jī)體受某些抗原刺激后產(chǎn)生不完全抗體，其與相應(yīng)抗原結(jié)合后不出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象，但能封閉抗原決定簇，使其不能再與完全抗體結(jié)合，故又稱“封閉抗體”。方法：將人球蛋白，注入異種動(dòng)物，獲得抗球蛋白。此種抗體加入表面結(jié)合有不完全抗體的紅細(xì)胞的復(fù)合物中，就能出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。第五十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏抗球蛋白試驗(yàn)的作用可檢測紅細(xì)胞表面結(jié)合的封閉抗體或游離在血清中的封閉抗體，多用于母體Rh（D）抗體檢測或自身免疫性溶血性貧血癥診斷。第五十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏協(xié)同凝集試驗(yàn)原理：金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁含有一種特殊的蛋白質(zhì)（稱金黃色葡萄球菌蛋白A，SPA），能與血清中IgG抗體的Fc段非特異性結(jié)合，兩個(gè)保持活性的Fab暴露在菌體（起載體作用）表面，與特異性抗原相遇時(shí)，能出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。應(yīng)用：微生物的快速診斷與鑒定，以協(xié)助傳染病的早期診斷。第五十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏冷凝集試驗(yàn)原理：冷凝集素是紅細(xì)胞某些抗原的自身抗體，只能在低溫時(shí)與其相應(yīng)的抗原結(jié)合。冷凝集反應(yīng)在4℃時(shí)最強(qiáng)烈，紅細(xì)胞凝集最明顯；溫度升高后，抗原抗體復(fù)合物解離，凝塊消失。意義：冷凝集素增高常見于單核細(xì)胞增多癥和支原體肺炎，惡性淋巴瘤通常伴隨冷凝集素慢性增高。第五十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.3.3免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是指用酶、熒光素、同位素等物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，檢測抗原或抗體的技術(shù)。具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫標(biāo)記技術(shù)可分為：放射免疫分析酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)親和標(biāo)記的免疫分析第六十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏放射免疫分析（RIA）同位素標(biāo)記的免疫分析法，常用同位素有125I，131I，3H，35S。方法：液相反應(yīng)體系用液體閃爍儀計(jì)數(shù)；固相反應(yīng)體系用X射線膠片顯影。應(yīng)用：廣泛用于激素、藥物等小分子化合物的定量分析，是靈敏、可靠的免疫分析方法之一。第六十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將抗原或抗體吸附在固相（如聚苯乙烯微量板、磁珠等）表面，用酶標(biāo)抗體或抗原與之反應(yīng)后，根據(jù)固定酶催化底物顏色變化的深淺檢測抗原或抗體，此所謂酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。廣泛用于食品安全檢測、病原體鑒定、生物大分子甄別及藥物組分分析等諸多領(lǐng)域。根據(jù)檢測方法特點(diǎn)和性質(zhì)的不同可分為：直接法間接法夾心法競爭法dot-ELISAELISPOT第六十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏直接法原理：抗原或抗體固定酶標(biāo)抗體或抗原與固相反應(yīng)，洗脫游離的抗原或抗體固定的酶量與受檢物量正相關(guān)底物酶促反應(yīng)，產(chǎn)物顏色深淺反映受檢物量多少。常用酶類：辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AKP）β-半乳糖苷酶（β-GAL）第六十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，利用酶標(biāo)記的抗抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱間接法。間接法操作流程如下：抗原固定，洗滌；加受檢樣本，充分反應(yīng)后洗滌；加酶標(biāo)抗抗體，充分反應(yīng)后洗滌；加底物顯色，顏色深度代表樣本中受檢抗體的量。第六十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏夾心法根據(jù)性質(zhì)不同可分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法，雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。雙抗體夾心法操作步驟如下：抗體固定，洗滌；加受檢樣本，充分反應(yīng)后洗滌；加酶標(biāo)抗體，充分反應(yīng)后洗滌，此時(shí)固定的酶量與樣本中受檢物的量正相關(guān)；加底物，夾心復(fù)合物中的酶催化底物成有色產(chǎn)物，據(jù)顏色深淺可對(duì)受檢物定性或定量。第六十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，說明其操作步驟如下：抗體包被，洗滌。待測管中加受檢樣本與一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，充分反應(yīng)后洗滌；參考管中只加酶標(biāo)抗原，充分反應(yīng)后洗滌。分別加底物顯色，參考管與待測管顏色深度之差，代表受檢樣本抗原的量，待測管顏色越淡，表示樣本中抗原含量越多。第六十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏dot-ELISA在硝酸纖維素膜上進(jìn)行的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)稱為斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（dot-ELISA）。原理：固定抗原或抗體后，洗脫，加酶標(biāo)抗體或抗原反應(yīng)，再洗脫。最后的顯色反應(yīng)要用一些特殊的底物，使酶促反應(yīng)生成不溶于水的有色產(chǎn)物。根據(jù)膜上沉淀斑點(diǎn)顏色深淺進(jìn)行定性和定量分析，使用斑點(diǎn)掃描儀可以進(jìn)行定量測定。第六十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏ELISPOTELISPOT即酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，其原理與普通ELISA相似，但顯色后在細(xì)胞分泌特定蛋白的位置顯現(xiàn)清晰的斑點(diǎn)，可直接鏡檢計(jì)數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。應(yīng)用領(lǐng)域：用已知抗原檢測分泌特異性抗體的B細(xì)胞；用細(xì)胞因子抗體檢測細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子；移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測、自身免疫病研究、腫瘤研究、抗原決定簇圖譜分析等。第六十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。標(biāo)記已知抗體成熒光抗體，以此為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原?？乖贵w復(fù)合物攜帶熒光素，利用熒光顯微鏡觀察樣本，可見熒光所在的細(xì)胞或組織，從對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位乃至定量檢測。常用熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）羅丹明（紅色熒光）第六十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏親和標(biāo)記的免疫分析利用一些特殊蛋白的親和作用，結(jié)合熒光標(biāo)記或酶標(biāo)方法可以避免酶標(biāo)抗體制備的繁瑣，廣泛應(yīng)用于免疫分析系統(tǒng)。常用的親和標(biāo)記系統(tǒng)有：SPA能與Fcγ結(jié)合，故可用作熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗抗體；小分子生物素能與親和素或鏈親和素組成生物素親和素系統(tǒng)（BAS），結(jié)合親和素或鏈親和素的熒光或酶標(biāo)抗體，可用于抗體芯片系統(tǒng)。第七十頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.3.4補(bǔ)體參與的抗原抗體反應(yīng)原理：抗原抗體復(fù)合物可激活補(bǔ)體，活化的補(bǔ)體可以殺傷細(xì)胞，據(jù)此可用一定量的補(bǔ)體和致敏紅細(xì)胞來檢測抗原抗體間有無特異性結(jié)合，進(jìn)而判斷受檢物存在與否或存在量的多少。典型應(yīng)用：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測抗原，如診斷傳染病、鑒定病原體等。溶血空斑試驗(yàn)檢測抗體合成細(xì)胞。第七十一頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)組成部分：實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：待測抗原或抗體、對(duì)應(yīng)已知抗體或抗原；指示系統(tǒng)：補(bǔ)體、紅細(xì)胞、溶血素（即紅細(xì)胞抗體）。第七十二頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏7.3.5常用免疫分析方法的靈敏度反應(yīng)名稱靈敏度(/L)反應(yīng)名稱靈敏度(/L)血清蛋白電泳（區(qū)帶電泳）1000mg免疫比濁1.0mg免疫電泳50～100mg補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)10μg單向免疫擴(kuò)散＜10～20mg凝集反應(yīng)10μg雙向免疫擴(kuò)散＜10mgELISA＜10μg火箭電泳＜5.0mgRIA＜10μg對(duì)流免疫電泳＜1.0mg第七十三頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏滴度測定示意圖第七十四頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏雜交瘤技術(shù)第七十五頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單抗制備原理流程圖第七十六頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏單抗制備技術(shù)流程圖第七十七頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏基因工程抗體第七十八頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏人－鼠嵌合抗體的制備第七十九頁，共一百零七頁，2022年，8月28日2011春夏雙特異性抗體殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制第八十頁，共一百零七頁，2