多糖的電泳和層析技術(shù)研究進展

多糖的化學(xué)性質(zhì)多糖（polysaccharide）糖鏈高分子碳水化合物多糖：相同的單糖組成eg—淀粉、纖維素和糖原雜多糖：不同的單糖組成eg—阿拉伯膠和肝素1.一般不溶于水

2.無甜味

3.不能形成結(jié)晶

4.無還原性和變旋現(xiàn)象當(dāng)前1頁，總共25頁。多糖的藥理作用polysaccharide抗腫瘤

抗病毒

降血糖

抗炎

抗補體電泳技術(shù)層析技術(shù)當(dāng)前2頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)多糖分子在一定pH值的緩沖體系中也會解離帶電，帶電的離子在電場的作用下向一定的方向泳動，電荷和分子大小決定了分子泳動速率，根據(jù)泳動速率的不同即可分離多糖。多糖研究中用到的電泳方法主要有紙電泳、醋酸纖維膜電泳、凝膠電泳、毛細管電泳四種。多糖電泳技術(shù)的原理當(dāng)前3頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)—紙電泳紙電泳原理紙電泳是根據(jù)電泳現(xiàn)象在滲透了緩沖液的紙上加上電場使物質(zhì)移動的電泳技術(shù)，根據(jù)支持物材質(zhì)不同可分為濾紙電泳和玻璃纖維紙電泳兩種。電泳采用的緩沖液以硼酸鹽較普遍，因糖類物質(zhì)中的相鄰羥基易與硼酸離子結(jié)合，生成硼酸復(fù)鹽，增加了電導(dǎo)性。當(dāng)前4頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)—紙電泳濾紙電泳操作步驟8cm×24cm濾紙條載玻片線形點樣400V電泳2小時乙醇固定高碘酸溶液70%乙酸溶液沖洗亞硫酸品紅30min，糖處呈現(xiàn)紫紅色玻璃纖維紙電泳操作步驟5cm×20cm玻璃纖維紙800V電泳40分鐘自然晾干，茴香胺硫酸溶液噴霧染色100℃烘烤15分鐘顯棕黃色載玻片線形點樣當(dāng)前5頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)—醋酸纖維膜電泳醋酸纖維膜電泳的原理醋酸纖維素膜電泳是以醋酸纖維素膜為介質(zhì)，其電泳原理與紙電泳基本相同。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙?；?，溶于丙酮后可涂布成均一的微孔薄膜，即醋酸纖維素膜。當(dāng)前6頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)—醋酸纖維膜電泳醋酸纖維膜電泳操作步驟2cm×8cm醋酸纖維薄膜緩沖液取出膜條夾在兩層濾紙內(nèi)吸去多余的緩沖液浸泡15min1mm×5mm薄膜浸漬樣品溶液約1μL緊貼在離膜條一端2cm處點樣250V，電泳20分鐘晾干，甲苯胺藍溶液染色90%的乙醇漂洗多糖處為藍色色斑當(dāng)前7頁，總共25頁。多糖的電泳技術(shù)—凝膠電泳凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳淀粉凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）當(dāng)前8頁，總共25頁。凝膠電泳—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）多糖的PAGE原理由于多糖的分子量較大，高分離膠的濃度才能使線性酸性多糖分子像球狀蛋白分子一樣在電場的作用下實現(xiàn)分離，因此分離膠濃度一般選用7.5%~8%。多糖復(fù)合物的解離程度較微弱，電荷密度低又具有糖單元不均一性、不對稱性，以致多糖的電泳帶中呈帶狀分布，帶狀越明顯，說明多糖的單元成分和結(jié)構(gòu)就越復(fù)雜。當(dāng)前9頁，總共25頁。凝膠電泳—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）判斷海洋硫酸多糖相對分子量大小和分布情況1.配制緩沖液 （1）分散緩沖液：硼酸3.09g，Tris6.15g，EDTA1.86g，加水溶解，定容至500ml（pH8.3） （2）上層緩沖液：甘氨酸46.92g，Tris12.12g，加水溶解，定容至500ml （3）分離膠緩沖液：丙烯酰胺10g，亞甲雙丙烯酰胺1.0g，蔗糖7.5g，用pH8.3分散緩沖液溶解，定容至50ml （4）濃縮膠緩沖液：丙烯酰胺2.375g，亞甲雙丙烯酰胺0.125g，溶于40ml分散緩沖液中，用0.1mol/L鹽酸調(diào)pH6.3，定容至50ml2.制膠 （1）分離膠緩沖液6ml、10%APS36μl、TEMED6μl制成分離膠 （2）濃縮膠緩沖液2ml、10%APS60μl、TEMED2μl制成濃縮膠3.海洋硫酸多糖供試品上樣CHS1、CHS2、DPS和GAS各上樣6μg當(dāng)前10頁，總共25頁。凝膠電泳—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）200V、溫度25℃電泳2小時0.5%的阿利新藍溶液水脫色幾種海洋硫酸多糖的PAGE電泳圖譜均呈帶狀分布從而可看出其相對分子量呈連續(xù)分布1.CHS2；2.對照品肝素；3.低分子肝素；4.CHS1；5.DPS；6.GAS當(dāng)前11頁，總共25頁。凝膠電泳—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）譜圖經(jīng)圖象掃描分析軟件處理后可得到數(shù)字化圖譜，求得CHS1、CHS2、DPS和GAS的相對分子量分布分別為3000~10000、6200~8200、4000~7400、3100~7700。當(dāng)前12頁，總共25頁。凝膠電泳—瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳的原理多糖的瓊脂糖凝膠電泳也是依據(jù)電荷密度和分子量差異進行分離，制膠濃度在0.5%~1.2%之間，上樣量3~5μl（約含1~10μg多糖），電泳后用甲苯胺藍溶液染色，值得注意的是，因甲苯胺藍不易使中性糖染色，樣品以酸性多糖為宜。當(dāng)前13頁，總共25頁。幾種多糖電泳技術(shù)的比較電泳技術(shù)電極緩沖液染色劑指示劑脫色劑濾紙電泳硼酸鹽緩沖液（pH10.0）高碘酸西夫試劑+亞硫酸品紅溶液無70%乙酸+亞硫酸鹽沖洗液玻璃纖維紙電泳0.025mol/L硼酸鹽緩沖液（pH10.2）p-茴香胺硫酸試劑無無醋酸纖維膜電泳硼酸鹽緩沖液（pH12.5）0.5%甲苯胺藍溶液無90%乙醇或1%醋酸聚丙烯酰胺凝膠電泳Tris-HCL緩沖液，pH9.1高碘酸西夫試劑、麝香草酚溶劑混合物或0.1%阿利新藍溴酚藍用阿利新藍染色時用7%醋酸、0.6mol/HCL漂洗瓊脂糖凝膠電泳0.06mol/L巴比妥緩沖液或0.05mol/L乙二胺緩沖液（pH8.5）0.1%甲苯胺藍溶液無醋酸：乙醇：水=0.1:5:5當(dāng)前14頁，總共25頁。其他多糖電泳技術(shù)毛細管電泳的原理毛細管電泳（CE）具有快速、高效和高靈敏度、所需樣品少等特點。CE是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的液相分離技術(shù)。毛細管電泳主要用于分析多糖中的單糖組分。其操作的一般過程為水解多糖樣品，水解產(chǎn)物與混合標(biāo)準(zhǔn)多糖分別進行衍生化反應(yīng)，然后取產(chǎn)物進入高效毛細管電泳分析，得出的樣品圖譜和標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比對。當(dāng)前15頁，總共25頁。另外兩種常用的多糖電泳技術(shù)1mol/LH2SO41mL100℃封管水解10mgGBSP6小時，冷卻后，3000r/min離心5min，取上清液，BaCO3中和5000r/min離心10min，取上清50μL待衍生。取樣品上清50μL和標(biāo)準(zhǔn)單糖各10mg，加入40μL衍生劑，80℃衍生1小時，加500μL三氯甲烷及500μL雙蒸水，混勻，6000r/min離心15分鐘，取上清用于高效毛細管電泳分析。電泳緩沖液為pH10.2的50mmol/L硼砂緩沖液，電壓16kV，毛細管：50μm（id）×27cm；UV：254nm。1.L-鼠李糖；2.葡萄糖；3.4-D-甘露糖；4.D-半乳糖；5.GBSP如銀杏白果多糖（GBSP）的成分分析當(dāng)前16頁，總共25頁。另外兩種常用的多糖電泳技術(shù)等電聚焦電泳是PAGE電泳的一種特殊方法，以兩性電解質(zhì)為載體，在電場中逐步形成pH梯度，電泳時把具有兼性離子電解質(zhì)的生物樣品聚焦，達到等電狀態(tài)相應(yīng)有效pH梯度時，利用凝膠的抗對流作用使其不被擴散，達到分離目的。在多糖分離中針對的是酸性多糖樣品，根據(jù)酸性多糖解離度不同而實現(xiàn)分離。等電聚焦電泳的原理當(dāng)前17頁，總共25頁。多糖的層析技術(shù)層析技術(shù)是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異，造成混合物中各組分距離不等的遷移，從而達到分離的目的。多糖研究中常用的有紙層析、柱層析。層析技術(shù)吸附力分子親和力分配系數(shù)分子形狀和大小分子極性當(dāng)前18頁，總共25頁。多糖的層析技術(shù)—紙層析多糖經(jīng)酸（硫酸或鹽酸）水解成單糖，再進行紙層析（1）常用的溶劑系統(tǒng) 粘多糖：0.067mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.4） 直鏈淀粉：75%異丙醇（V/V）：乙醇=9：1（V/V）（2）斑點的檢出 1）鑒定直鏈淀粉用苯胺一鄰苯二甲酸試劑 2）鑒定還原性多糖用Sornogyi試劑 3）鑒定粘多糖用甲苯胺藍試劑 4）鑒定淀粉用1%碘乙醇溶液當(dāng)前19頁，總共25頁。多糖的層析技術(shù)—柱層析纖維素柱層析陰離子交換柱層析凝膠柱層析親和層析氣相層析高效液相層析當(dāng)前20頁，總共25頁。柱層析—纖維素柱層析纖維素柱層析中的載體是纖維素。先用乙醇液將柱內(nèi)纖維素平衡好，然后多糖混合物沉淀于惰性的纖維素上面。用不同濃度乙醇水溶液（如80%，60%，40%，20%）階梯洗脫，不同多糖就依次洗脫出來。先洗脫的是分子量最小的多糖，最終洗脫的是分子量最大的多糖。纖維素柱層析的原理當(dāng)前21頁，總共25頁。柱層析—陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析的原理陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖，是目前多糖純化中應(yīng)用最普遍的一種方法，特別是對于體積較大的多糖溶液，大多首先采用陰離子交換柱層析進行濃縮及初步純化當(dāng)前22頁，總共25頁。柱層析—陰離子交換柱層析常用的陰離子交換劑DEAE-纖維素DEAE-葡聚糖DEAE-瓊脂糖多糖的分離純化×（1）流速過慢（2）柱床高度會隨緩沖液濃度及pH的改變而改變（3）穩(wěn)定性差（4）使用壽命短原因在于：化學(xué)穩(wěn)定性好、流速快的SepharoseFF當(dāng)前23頁，總共25頁。柱層析—陰離子交換柱層析DEAE-32纖維素柱層析分析蟲草多糖組分DEAE-32纖維素層析柱的制備：DEAE-32纖維素粉→溶脹→漂洗3次→1mol/LNaOH浸泡4h→蒸餾水洗至中性→1mol/LHCl浸泡4h→蒸餾水洗至中性→重復(fù)3~5次→裝柱→平衡→加樣→洗脫（速度為5ml/10min）冬蟲夏草胞外多糖蒸餾水洗脫曲線

冬蟲夏草胞內(nèi)多糖蒸餾水洗脫曲線當(dāng)前24頁，總共25頁。柱層析—凝膠柱層析一、葡聚糖凝膠(Sep