臨床酶學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一節(jié)酶學(xué)基本知識(shí)●

酶的本質(zhì)---絕大部分的酶是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸和酶蛋白組成的復(fù)合體，極少數(shù)酶的本質(zhì)是核酸?！?/p>

酶的特性---極高的催化效率、高度的特異性(specificity)以及催化作用的可調(diào)節(jié)性●

酶的結(jié)構(gòu)與功能

單純酶

酶蛋白(apoenzyme)

結(jié)合酶

輔酶(coenzyme)

輔因子(cofactor)

輔基(prostheticgroup)第一頁(yè)，共29頁(yè)?！?/p>

酶是蛋白質(zhì)，具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，有些酶還具有四級(jí)結(jié)構(gòu)?！?/p>

單體酶(monomericenzyme)---只由一條多肽鏈構(gòu)成●

寡聚酶(oligomericenzyme)---由多個(gè)相同或不同亞基以非共價(jià)鍵連接的酶●

多酶體系(multienzymesystem)---由幾種不同功能的酶彼此聚合而成的多酶復(fù)合物●

酶的必需基團(tuán)(essentialgroup)---與酶的活性密切相關(guān)的基團(tuán)●

酶的活性中心(activecenter)---組成具有能與底物結(jié)合并起催化反應(yīng)的特定空間結(jié)構(gòu)區(qū)域第二頁(yè)，共29頁(yè)。酶的命名、分類與編號(hào)●

酶的命名---習(xí)慣命名法、系統(tǒng)命名法●

酶的分類---可分為六大類氧化還原酶(oxido-reductases)、轉(zhuǎn)移酶(transferases)、水解酶(hydrolases)、裂解酶(或裂合酶)(lyases)、異構(gòu)酶(isomerases)、合成酶(或連接酶)(synthetases或ligases)●

酶的編號(hào)---用4個(gè)數(shù)字加以系統(tǒng)編號(hào)第一個(gè)數(shù)字表示酶的類別，第二個(gè)表示亞類，第三個(gè)表示亞-亞類，第四個(gè)表示酶的編號(hào)序數(shù)。第三頁(yè)，共29頁(yè)。

習(xí)慣用名英文縮寫(xiě)EC編號(hào)系統(tǒng)名乳酸脫氫酶LD（LDH）1.1.1.27L乳酸：NAD+氧化還原酶單胺氧化酶MAO1.4.3.4單胺：氧化還原酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶γ-GT/GGT2.3.2.2γ-谷氨酰肽：氨基酸γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST2.6.1.1L-門(mén)冬氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶）(GOT)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT2.6.1.2L-丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）(GPT)肌酸激酶CK2.7.3.2三磷酸腺苷：肌酸轉(zhuǎn)磷酸酶堿性磷酸酶ALP(AKP)3.1.3.1正磷酸單酯磷酸水解酶臨床酶學(xué)分析中常用酶的名稱與編號(hào)第四頁(yè)，共29頁(yè)。第五頁(yè)，共29頁(yè)。三、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（一）酶促反應(yīng)

方程第六頁(yè)，共29頁(yè)。（二）酶促反應(yīng)進(jìn)程第七頁(yè)，共29頁(yè)。（三）酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1．反應(yīng)速度2．米氏常數(shù)

(1)初速度指在反應(yīng)最初階段底物的消耗量很小（一般在50%以內(nèi)）時(shí)的反應(yīng)速度(2)最大反應(yīng)速度指當(dāng)酶的結(jié)合位點(diǎn)與底物結(jié)合飽和時(shí)的反應(yīng)速度第八頁(yè)，共29頁(yè)。(四)酶偶聯(lián)反應(yīng)

ABCD

酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶

Ei——指示酶Ea——輔助酶ExEiEa工具酶第九頁(yè)，共29頁(yè)。第十頁(yè)，共29頁(yè)。第二節(jié)血清酶變化的生理病理機(jī)制一、血清酶的來(lái)源與去路

（一）血清酶的來(lái)源

1．血漿固有酶2．非血漿固有酶①外分泌酶②細(xì)胞酶

（二）血清酶的去路

1．腎小球?yàn)V過(guò)從尿液中排出2．網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除3．血管內(nèi)失活或滅活第十一頁(yè)，共29頁(yè)。二、血清酶變化的生理病理機(jī)制

（一）血清酶的生理差異1．性別2．年齡3．飲食4．運(yùn)動(dòng)5．妊娠（二）血清酶變化的病理機(jī)制

1．酶合成異常2．細(xì)胞內(nèi)酶的滲漏3．酶進(jìn)入血液的方式4．其他血管內(nèi)的抑制作用、清除速度第十二頁(yè)，共29頁(yè)。

(一)酶活性單位

1．慣用單位2．國(guó)際單位---在特定的條件下，一分鐘內(nèi)使底物轉(zhuǎn)變一微摩爾的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。3．Katal單位---在規(guī)定條件下，每秒鐘催化轉(zhuǎn)化一摩爾底物的酶量。1katal＝60×106U

第三節(jié)酶含量的表示方法

一、酶活性濃度表示法

第十三頁(yè)，共29頁(yè)。（二）酶活性濃度指單位體積樣品中的酶活性單位（三）正常上限升高倍數(shù)（ULN)

是指用測(cè)得的酶活性結(jié)果除以參考范圍上限第十四頁(yè)，共29頁(yè)。第十五頁(yè)，共29頁(yè)。二、酶蛋白質(zhì)量濃度表示法

測(cè)定酶蛋白質(zhì)量濃度優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高②特異性高③可測(cè)定無(wú)活性的酶④與酶活性測(cè)定一起，計(jì)算免疫比活性⑤在同工酶測(cè)定中更有價(jià)值第十六頁(yè)，共29頁(yè)。第四節(jié)酶催化活性濃度測(cè)定的理論基礎(chǔ)一、定時(shí)法二、連續(xù)監(jiān)測(cè)法

第十七頁(yè)，共29頁(yè)。（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法的方法設(shè)計(jì)

1．以人工合成色素原做底物的連續(xù)監(jiān)測(cè)2．NAD(P)H的連續(xù)監(jiān)測(cè)3．以Trinder反應(yīng)做指示反應(yīng)的連續(xù)監(jiān)測(cè)4．特殊反應(yīng)類型的連續(xù)監(jiān)測(cè)第十八頁(yè)，共29頁(yè)。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素與最適條件的確定一、方法因素的影響（一）正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)（二）檢測(cè)底物或檢測(cè)產(chǎn)物（三）底物啟動(dòng)模式與樣品啟動(dòng)模式第十九頁(yè)，共29頁(yè)。二、測(cè)定條件的影響與最適條件的確定（一）底物種類和濃度（二）緩沖液種類、pH和離子強(qiáng)度（三）反應(yīng)溫度（四）輔助因子和激活劑（五）抑制劑（六）酶偶聯(lián)法中的輔助酶和指示酶（七）延滯期與線性期的確定（八）樣品與試劑比例第二十頁(yè)，共29頁(yè)。三、其他因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響（一）儀器（二）校準(zhǔn)物（三）實(shí)驗(yàn)參數(shù)（四）副反應(yīng)第二十一頁(yè)，共29頁(yè)。第六節(jié)同工酶檢測(cè)技術(shù)一、電泳法二、抑制法三、其他方法

（一）熱變性（二）親和層析法

第二十二頁(yè)，共29頁(yè)。

免疫抑制法

利用同工酶的一種亞基與相應(yīng)的抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，測(cè)定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化，可以計(jì)算出該型同工酶的活性。不加抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性：CK-MM和CK-MB活性；加入抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性：50％CK-MB的活性；加入抗CK-MM血清時(shí)樣品的CK活性×2：CK-MB活性；所測(cè)CK-MM和CK-MB之總活性－CK-MB活性＝CK-MM活性。第二十三頁(yè)，共29頁(yè)。第七節(jié)目前常用診斷酶的酶活性測(cè)定一、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定

第二十四頁(yè)，共29頁(yè)。L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸丙酮酸＋NADH＋H+乳酸＋NAD+ALT（樣品）LD（試劑）酶耦聯(lián)法測(cè)定ALT340