蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)相互作用現(xiàn)在是1頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)并明確其相互作用的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)相互作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)相互作用的核心“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反映了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對象合適的研究方法現(xiàn)在是2頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用需要微觀和宏觀的結(jié)合象與象的一部分現(xiàn)在是3頁\一共有64頁\編輯于星期五定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)Input：10~20mgtotalproteinsIPsample：Immunoprecipitatedfrom1000mgoftotalproteins現(xiàn)在是4頁\一共有64頁\編輯于星期五定量分析是研究蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)Relativeexposurelevel現(xiàn)在是5頁\一共有64頁\編輯于星期五

研究蛋白質(zhì)相互作用的意義1、蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用的主體。蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)揮其功能的主要活動?，F(xiàn)在是6頁\一共有64頁\編輯于星期五穩(wěn)定相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合體

（proteincomplex）瞬時(shí)相互作用（enzyme-substrate）生物學(xué)效應(yīng)穩(wěn)定的相互作用與瞬間的相互作用共同構(gòu)成蛋白質(zhì)相互作用的內(nèi)涵?，F(xiàn)在是7頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用是為了研究相應(yīng)的生物學(xué)功能確定研究目標(biāo)尋找相互作用建立相互作用網(wǎng)絡(luò)和功能體系現(xiàn)在是8頁\一共有64頁\編輯于星期五從蛋白質(zhì)相互作用到生物學(xué)功能。運(yùn)用蛋白質(zhì)直接相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用的生物學(xué)意義。容易犯的錯(cuò)誤：研究一大堆的蛋白相互作用，卻不知道這些相互作用有什么生物學(xué)意義。從物學(xué)功能到蛋白質(zhì)相互作用。通過改變生物學(xué)現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間的遺傳相互作用，進(jìn)一步研究相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。容易犯的錯(cuò)誤：找到了平行變化的不相關(guān)蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在是9頁\一共有64頁\編輯于星期五發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用遺傳功能分析序列與結(jié)構(gòu)比較模擬驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用不同方法的交叉驗(yàn)證不同生物體系中驗(yàn)證現(xiàn)在是10頁\一共有64頁\編輯于星期五ProteininteractionAffinity:A+B=ABKd=[A][B]/[AB],Kd:dissociationconstantInteractionKdStreptavidin-biotinbinding10-14MAntibody-antigeninteraction(good)10-8-10-10MAntibody-antigeninteraction(weak)10-6MEnzyme-substrate10-6-10-10M蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用現(xiàn)在是11頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）現(xiàn)在是12頁\一共有64頁\編輯于星期五Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Westernblot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)的存在與否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于鑒定不同蛋白質(zhì)間的相互作用。免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結(jié)合：Pr1－Ab－Pr2抗體篩庫：cDNA表達(dá)庫，抗體結(jié)合表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而得到基因。已經(jīng)被質(zhì)譜和PCR所淘汰現(xiàn)在是13頁\一共有64頁\編輯于星期五Westernblot1、電轉(zhuǎn)移效率2、PVDF膜的充分浸潤3、轉(zhuǎn)移液中有太多的SDS4、膜的損壞5、轉(zhuǎn)移時(shí)膠和膜沒有完全接觸6、抗體的問題7、抗體的濃度太高或太低8、還原性物質(zhì)的存在9、封閉不充分現(xiàn)在是14頁\一共有64頁\編輯于星期五SDS－PAGEacrylamide的濃度蛋白質(zhì)上樣的量相鄰泳道的蛋白質(zhì)量、離子強(qiáng)度和樣品體積轉(zhuǎn)移膜：PVDF膜nitrocellulose膜抗體現(xiàn)在是15頁\一共有64頁\編輯于星期五免疫共沉淀免疫共沉淀：Ab－Pr1－Pr2非特異性結(jié)合：Pr1－Ab－Pr2現(xiàn)在是16頁\一共有64頁\編輯于星期五免疫共沉淀12354抗體很差，Westernblot問題Loading比例不對樣品太多正確現(xiàn)在是17頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）現(xiàn)在是18頁\一共有64頁\編輯于星期五Affinityinteraction（親和作用）GSTpulldown：已知蛋白質(zhì)和GST融合，與細(xì)胞或組織的“蛋白質(zhì)湯”混合，用谷胱甘肽親和層析分離和已知蛋白質(zhì)結(jié)合的新蛋白質(zhì)。GSTtag。Biotin－Avidin結(jié)合：Biotin標(biāo)記已知蛋白質(zhì)，通過Avidin結(jié)合biotin標(biāo)記的蛋白質(zhì)，從而得到與biotin標(biāo)記蛋白結(jié)合的新蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)是biotin－avidin的結(jié)合是最牢靠的；缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)結(jié)合biotin的蛋白質(zhì)很多。各種不同的tag。許多現(xiàn)在是19頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution現(xiàn)在是20頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldownGSTfusionprotein不夠純，用作bait會產(chǎn)生太多的非特異性蛋白質(zhì)污染?，F(xiàn)在是21頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTpulldown現(xiàn)在是22頁\一共有64頁\編輯于星期五GSTPulldownbindingwashelution現(xiàn)在是23頁\一共有64頁\編輯于星期五Biotin－Avidin結(jié)合：生物界最穩(wěn)定的結(jié)合之一現(xiàn)在是24頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）現(xiàn)在是25頁\一共有64頁\編輯于星期五Yeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）

發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)

鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用

確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán)現(xiàn)在是26頁\一共有64頁\編輯于星期五lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ現(xiàn)在是27頁\一共有64頁\編輯于星期五發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2現(xiàn)在是28頁\一共有64頁\編輯于星期五確定蛋白質(zhì)間相互作用的功能基團(tuán)ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白現(xiàn)在是29頁\一共有64頁\編輯于星期五鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：相互作用白：不相互作用現(xiàn)在是30頁\一共有64頁\編輯于星期五Two-Hybrid的優(yōu)點(diǎn)：是酵母細(xì)胞內(nèi)的invivo相互作用。只需要cDNA，簡單。弱的相互作用也能檢測到?，F(xiàn)在是31頁\一共有64頁\編輯于星期五Two-Hybrid的缺點(diǎn)：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用。酵母的翻譯后修飾不盡相同。尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾。自身激活報(bào)告基因。都基因庫的要求比較高，單向1/3是inframe蛋白質(zhì)毒性。第三者Z插足介導(dǎo)的相互作用。假陽性。現(xiàn)在是32頁\一共有64頁\編輯于星期五lacZUASDBXlacZDBXAutoactivationBDXMarker1ADYlacZUASADYlacZADYMarker2現(xiàn)在是33頁\一共有64頁\編輯于星期五Phagedisplay（噬菌體展示）現(xiàn)在是34頁\一共有64頁\編輯于星期五Phagedisplay（噬菌體展示）Phagedisplay的最大優(yōu)點(diǎn)是數(shù)量大細(xì)胞：108~109細(xì)菌：1010Phage：1012尋找受體的配體7肽：8x1016現(xiàn)在是35頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）現(xiàn)在是36頁\一共有64頁\編輯于星期五SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions.SurfacePlasmonResonance現(xiàn)在是37頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是38頁\一共有64頁\編輯于星期五SPR優(yōu)點(diǎn)：無標(biāo)記、實(shí)時(shí)Label-freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions.Itfollowseverystepinamulti-stepanalysisprocedure,incontrasttolabel-basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep.RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly,asaplotofresponse(whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface)againsttime.Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis.Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun,forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction.現(xiàn)在是39頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)直接相互作用Co-immunoprecipitationandantigen-antibodyinteraction（免疫共沉淀和抗原抗體結(jié)合）Affinityinteraction（親和作用）Yeasttwo-hybridandphagedisplay（酵母雙雜交和噬菌體展示）SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）現(xiàn)在是40頁\一共有64頁\編輯于星期五DonorAcceptor(2-10nm)

ExcitationfrequencyEmissionfrequency=Excitationfrequency

EmissionfrequencyFluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)現(xiàn)在是41頁\一共有64頁\編輯于星期五Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength(380nanometers)ofthedonorAcceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum(510nanometers)現(xiàn)在是42頁\一共有64頁\編輯于星期五ColordefiningGFPmutation(source)Blue(BFP)Y66HGreen(GFP)Y66WCyan(CFP)S65TYellowish(YFP)S65G,T203YRed(D.s.RFP)D.striataExcitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLowWavelengthoftheFluorescentProteins現(xiàn)在是43頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是44頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是45頁\一共有64頁\編輯于星期五現(xiàn)在是46頁\一共有64頁\編輯于星期五

Measureinteractionsbetweentwoproteinsin vivoVerysensitiveExcellentresolutionHelpfulincharacterizingmajorconformational changesinmacromoleculesDeterminetheinteractionqualitativelyand quantitativelyAdvantagesofFRET現(xiàn)在是47頁\一共有64頁\編輯于星期五LimitationsofFRETFRETonlyoccurswhenthetwofluorophoresarewithin2-10nmofeachother,whichmeansthatthefluorophoresmustbebroughttogetherviaverycloseprotein-proteininteractions.Requireexpensiveequipment.RequirelabelingofproteinsusingfluorophoreorGFPfusion現(xiàn)在是48頁\一共有64頁\編輯于星期五Proteomicanalysis（蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）有專門的課題加以介紹現(xiàn)在是49頁\一共有64頁\編輯于星期五研究蛋白質(zhì)相互作用的單分子技術(shù)：原子力相互作用現(xiàn)在是50頁\一共有64頁\編輯于星期五遺傳功能分析利用功能缺陷和互補(bǔ)來分析不同蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系。不是蛋白質(zhì)直接相互作用的證據(jù)，但可以提供進(jìn)一步研究的目標(biāo)。現(xiàn)在是51頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)遺傳相互作用（geneticinteraction）是功能性相互作用有A：小量表達(dá)；有B：無表達(dá)；有C：無表達(dá)ABCABC現(xiàn)在是52頁\一共有64頁\編輯于星期五有A和B：表達(dá)增加；有A和C：小量表達(dá)；有B和C：無表達(dá)ABCABC現(xiàn)在是53頁\一共有64頁\編輯于星期五有A、B和C：高表達(dá)在A、B和C的蛋白質(zhì)復(fù)合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結(jié)合并有小的轉(zhuǎn)錄活性；B可以和A結(jié)合促進(jìn)A的轉(zhuǎn)錄活性；C本身不能直接促進(jìn)A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導(dǎo)進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。ABC現(xiàn)在是54頁\一共有64頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)直接相互作用：從蛋白質(zhì)物理的相互作用