DNA的基本分子生物學(xué)操作

DNA的基本分子生物學(xué)操作

（表達(dá)載體的構(gòu)建）胥慧2009.9目前一頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)如何研究某個(gè)基因的功能?遺傳學(xué)

突變體

基因缺失或下調(diào)過量表達(dá)體內(nèi)/體外生化反應(yīng)基因轉(zhuǎn)入及表達(dá)!目前二頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)表達(dá)載體的構(gòu)建btbk轉(zhuǎn)化E.coli構(gòu)建正確的質(zhì)粒酶切鑒定轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌Western檢測表達(dá)BTBK的菌株目前三頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)表達(dá)載體構(gòu)建流程零、策略的設(shè)計(jì)一、PCR擴(kuò)增基因二、乙醇沉淀基因三、酶切基因及載體四、瓊脂糖凝膠電泳回收基因及載體五、連接六、轉(zhuǎn)化大腸桿菌七、質(zhì)粒的小量提取八、PCR/酶切鑒定及測序九、質(zhì)粒的大量提取目前四頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)/annotation/genome/neurospora/查找基因目前五頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)查找基因目前六頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)設(shè)計(jì)引物引物長度：18-22ntGC含量（DNAMANhybrid:50~60℃）DNAMAN檢查：游離3’端>8bp以G/C結(jié)尾酶切位點(diǎn)的選擇（巧用平端酶）保護(hù)堿基負(fù)義鏈引物注意反向考察是否移碼EcoRV(buffer3)HpaI(4)ScaI(3)SmaI(4)SnaBI(4)StuI(214)目前七頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)一、PCR

（Phusion/Taq）5XHFbuffer:10μlNEBdNTPs:0.5μl

Phusion:0.4

μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:37.1μl

98℃1min98℃10sec25X55℃30sec72℃1min72℃10min10℃∞Notes:1.Phusion酶的擴(kuò)增效率為每分鐘2~4kb.2.最后加酶！現(xiàn)用現(xiàn)取，取出冰浴。目前八頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)一、PCR10XPCRbuffer:5μlMgCl2:3μldNTPs:0.5μl

Taq:1μl

Primer1:0.5μl

Primer2:0.5μl

Template:1μl

ddH2O:38.5μl

94℃5min94℃30sec30X55℃30sec72℃2min72℃10min10℃∞請愛護(hù)PCR儀！反應(yīng)完及時(shí)取出；散熱5分鐘；嚴(yán)禁過夜。目前九頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)問題篇P不出來：

從自己操作檢查起；負(fù)義鏈引物是否忘記反向了；退火溫度是否合適（考慮降溫）；換模板；換Taq試；重設(shè)引物。大于5kb的基因考慮分兩段。

量太少：

增大模板量；降溫；多P幾管。非特異條帶：

若目的條帶比非特異亮，大膽升溫；若非特異比目的帶大，嚴(yán)格控制延伸時(shí)間；膠回收目的帶作模板再PCR。大小不對：

溫度；模板；重設(shè)引物。目前十頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)二、乙醇沉淀DNA1.合并PCR產(chǎn)物，用TEbuffer將體系擴(kuò)大至200μl，混勻。加入2~2.5V無水乙醇、1/10V醋酸鈉(3M,pH5.2)，混勻。2.置于-80℃30min以上,或者，液氮速凍。3.4℃12000rpm離心15min，倒掉上清。4.70%乙醇洗沉淀，吸盡上清，烘干。5.以適量ddH2O溶解DNA。Notes:離心后迅速倒掉乙醇，切忌反復(fù)看到底有沒有沉淀；可加完70%乙醇后再適當(dāng)離心；烘干后保持EP管豎直向上；充分溶解DNA。目前十一頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)三、酶切做酶切前必須研究NEB產(chǎn)品目錄！EcoRI目前十二頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)25度的50度的、60度的……三、酶切目前十三頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)三、酶切目前十四頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)酶切反應(yīng)體系50μl體系5μl體系buffer1/2/3/4/U:5μl0.5μlDNA:xμlaμl

Enzyme:1.5~2μl0.3μl

ddH2O:補(bǔ)足三、酶切目前十五頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)反應(yīng)的溫度:

大多數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度是37℃。25℃酶：ApaISmaI50℃酶：反應(yīng)時(shí)間:（NEB快速酶切產(chǎn)品:5min）一般2h。若切末端的幾個(gè)堿基，延長時(shí)間。研究NEB產(chǎn)品目錄！三、酶切目前十六頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)三、酶切目前十七頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)雙酶切不同反應(yīng)溫度的酶不可以作雙酶切。若兩者buffer相同，先切低溫酶，再切高溫酶；若buffer不同，用分步單酶切。參照NEB雙酶切表選擇buffer。考察兩個(gè)酶在建議的buffer中的活性，一般認(rèn)為活性75%及以上是可取的。不同buffer的酶用分步單酶切代替雙酶切。即酶1切乙醇沉淀酶2切，再膠回收。分步酶切質(zhì)粒時(shí)，若兩個(gè)酶切位點(diǎn)是緊臨的，則需考慮留出足夠的保護(hù)堿基。三、酶切----TTGATGAATTCCTGCAGCCC--------AACTACTTAAGGACGTCGGG----EcoRIPstI目前十八頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)酶的星活力：

在非標(biāo)準(zhǔn)條件下切割非特異序列產(chǎn)生非特異片段。產(chǎn)生星活力的原因：甘油>5%；pH>8.0；乙醇?xì)埩簟瓚?yīng)對方法：嚴(yán)格按照NEB產(chǎn)品目錄（buffer、適合的酶量、溫度、時(shí)間1~8h）三、酶切目前十九頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)注意事項(xiàng)----愛惜、珍惜每一點(diǎn)酶！加酶時(shí)才去取酶，始終保持酶在冰上，加完酶迅速放回-20℃！酶必須深埋入-20℃的冰盒?。ㄇ謇肀┡f酶用完后“涮”管子；保持同一種酶只有一管。新酶用前離心（甩）一下。蓋子和標(biāo)簽一一對應(yīng)，不要蓋錯(cuò)。三、酶切目前二十頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)四、膠回收瓊脂糖凝膠（Agarose）

Agarose濃度分離范圍0.7%0.8~12kb1.0%0.5~10kb1.2%0.4~7kb緩沖液:TAE

貯液：50X工作：1X制0.8%膠：0.8gAgarose100ml1XTAE本實(shí)驗(yàn)室常用：0.8%(500bp~10kb)低濃度膠2%(<1.5kb)高濃度膠微波化膠降溫加5μlEB目前二十一頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)電壓：5V/cm本實(shí)驗(yàn)室：膠回收用90V；檢測用120V。電泳方向：

DNA向正極泳動(dòng)；EB向負(fù)極泳動(dòng)。（跑過的膠的?？撞灰酥苯釉儆茫〥NA染料EB：高度靈敏的熒光染色劑302nm366nm紫外可嵌入DNA堿基間的三環(huán)平面基團(tuán)1EB/2.5個(gè)堿基加入：①直接加入膠中；②電泳后染色。配置：貯液10mg/ml；工作0.5ug/ml。5ulEB/100ml膠紫外透射反射儀：長波360nm回收用短波254nm四、膠回收目前二十二頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)Loadingbuffer（6X）配制6Xloadingbuffer：0.25%溴酚蘭0.25%二甲苯青30%甘油or40%蔗糖6XTAEddH2O上樣時(shí)5ulDNA+1ulloadingbuffer作用：①增加密度，使DNA沉降；②指示前沿在0.8%Agarose，溴酚蘭約相當(dāng)于0.5kb的DNA位置；二甲苯青約相當(dāng)于5kb的DNA位置。四、膠回收目前二十三頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)Marker四、膠回收目前二十四頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)回收膠：配新膠（厚度適中）；換新電泳緩沖液。切膠時(shí)盡量少帶空膠清洗刀片四、膠回收目前二十五頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)回收方法：液氮凍融法QIAGEN膠回收試劑盒Roche羅氏Transgene全氏Notes：1.溶膠后涼至室溫，加1V的異丙醇有助于提高回收效率。2.溶膠液重復(fù)過柱2~3次。3.最后洗脫DNA之前稍微干燥一下柱子。4.洗脫DNA用35~50ulMillipore水，如有必要可重復(fù)洗。四、膠回收目前二十六頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)跑膠檢測兩個(gè)片段的濃度連接反應(yīng)兩個(gè)片段的比例：摩爾比vector:insert=1:3即:=1:3例如設(shè)需要vector為xul，跑膠估測濃度80ng/3ul，大小為5.2kb；需要insert為yul，跑膠估測濃度120ng/3ul，大小為1kb。則:=1:3

五、連接nginsertkbinsertngvectorkbvector80x

5.2120y

1目前二十七頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)連接酶E.coliDNAligaseT4噬菌體DNAligase√保存:-20℃冰上最多5~10min!!現(xiàn)用現(xiàn)取，用完立即放回！T4buffer：250mMTris·Cl(pH7.6)50mMMgCl25mMATP5mMDTT25%PEG8000五、連接目前二十八頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)反應(yīng)體系T4buffer:0.5ulvector:xulinsert:yulT4ligase:0.4ul

25℃1h,then4℃1h.（T4連接酶4~25℃均可）T4連接酶效率很高，不需要懷疑。五、連接x+y=4.1ul目前二十九頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)六、轉(zhuǎn)化受體菌：JM109超級感受態(tài)----轉(zhuǎn)化效率高；生長快。70L感受態(tài)細(xì)胞中加入5LDNA，混勻，冰浴30min；42℃熱激90秒，快速將管轉(zhuǎn)移到冰上冷卻3～5min；加入800L液體LB培養(yǎng)基，混勻，37℃搖床慢搖（100~110rpm）45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；3000rpm離心10min。移除750ul左右的上清，輕柔重懸細(xì)胞，將其涂布到含相應(yīng)抗生素（Amp）的LB平板上。37℃倒置培養(yǎng)，10~16h后可出現(xiàn)菌落。（如檢查氨芐青霉素抗性，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板時(shí)細(xì)菌密度應(yīng)較低，培養(yǎng)時(shí)間不應(yīng)超過20h，否則會(huì)出現(xiàn)對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落）。*若轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，第4步不用離心，直接取10~50ul細(xì)胞涂板。目前三十頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)七、小提質(zhì)粒離心收集菌體，盡量除盡培養(yǎng)基；加100L冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，Vortex劇烈振蕩；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和顛倒5次；12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清到新管中；加2倍體積的無水乙醇沉淀DNA；12000rpm離心7min，倒掉上清；70%乙醇洗滌沉淀，吸盡上清，干燥；用30~50L含RNaseA的ddH2O溶解沉淀。（如果是過夜搖菌，則最后用50L。如果是白天搖菌，則用30L。）目前三十一頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)八、質(zhì)粒的鑒定PCR：P插入片段酶切鑒定測序（Invitrogen公司。可測菌液/質(zhì)粒/PCR產(chǎn)物）目前三十二頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)酶切鑒定：酶的選擇載體和插入片段上都有的酶可判斷出片段插入方向（靠近片段一側(cè)）酶切產(chǎn)生的條帶數(shù)為2~3條，不宜太多不宜有<500bp的小條帶優(yōu)選價(jià)格便宜的酶：EcoRV;EcoRI…鑒定用MBI的酶；5或10ul體系；0.3ul酶八、質(zhì)粒的鑒定目前三十三頁\總數(shù)四十頁\編于十二點(diǎn)九、大提質(zhì)粒50ml菌液分裝到24個(gè)離心管，分兩次離心收集菌體，盡量除盡培養(yǎng)基；加100L冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，Vortex劇烈振蕩；加200L新配制的溶液Ⅱ，加150L冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和顛倒5次；12000rpm