高中生物選修三基因工程的基本操作程序

高中生物選修三基因工程的基本操作程序第一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二補充：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)第二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)第四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟第七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴增3、人工合成請閱讀P9第一和二兩段第八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二1、從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）（1）.基因文庫第九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體1、從基因文庫中獲取目的基因限制酶與運載體連接導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）第十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二第十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①基因組文庫的構(gòu)建（2）.基因文庫的構(gòu)建方法通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因第十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)第十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二③基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二（3）構(gòu)建基因文庫的目的

怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情況下，獲得所需的目的基因。第十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性（4）從基因文庫中得到目的基因的方法——直接分離法(鳥槍法)第十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因第十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一第十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二⑥過程：第十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增第二十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等第二十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測3、人工合成法：在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？第二十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二1.作用：二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建-核心IMN2.組成：①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代。②同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。(3)終止子：是使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止(4)標(biāo)記基因：是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(2)啟動子：是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位(1)目的基因

不同受體細(xì)胞，目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建有所差異。（5）復(fù)制原點：是轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的起點。第二十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個切口兩個黏性末端復(fù)制原點+啟動子+目的基因+終止子+標(biāo)記基因第二十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二尋根問底：將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體細(xì)胞，沒有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞。此法目前爭議頗多，嚴(yán)格來說不算基因工程。第二十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二資料:

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。

然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料證明：表達(dá)載體構(gòu)建組成要完整第二十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第二十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二2.下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提取③從受體細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥1．在已知基因的核苷酸序列的情況下，獲取目的基因的最方便方法是

A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫法

C、CDNA文庫法

D、聚合酶鏈反應(yīng)第二十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二3.在基因工程中，把選出的一個目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4次，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是（）個A.540

B.8100

C.17280

D.7560第二十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二4.目的基因與運載體結(jié)合所需的條件有①同一種限制酶②具有抗性基因的質(zhì)粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA連接酶⑥四種脫氧核苷酸⑦ATPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦C．①②③④⑤D．①②④⑤⑦5.（多選）一個基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括

A．目的基因B．啟動子

C．終止子D．標(biāo)記基因ABCDD第三十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二常用的受體細(xì)胞：

大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。第三十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①特點:

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞能感染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②過程：Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并整合到其染色體上③適用生物：雙子葉植物、祼子植物。第三十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi質(zhì)粒蘇云金桿菌構(gòu)建表達(dá)載體Bt毒素蛋白基因

蘇云金桿菌DNA連接酶

T-DNA(可轉(zhuǎn)移-DNA)

知識拓展農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：第三十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二基因槍法：

利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法①操作方法：②金屬粒：將目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物第三十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二適用于單子葉植物基因槍法第三十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞①操作方法：②特點：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞十分簡便經(jīng)濟③例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉第三十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第三十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二花粉管通道法適用于被子植物第三十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二①細(xì)胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞發(fā)育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養(yǎng)成早期胚胎顯微注射取受精卵（體內(nèi)或體外受精）提純含目的基因表達(dá)載體受精卵第三十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二③常用法：②常用菌：①微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞Ca2+處理大腸桿菌感

受

態(tài)

細(xì)

胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA___感受態(tài)細(xì)胞法（3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞第四十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二（3）.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞

大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:

首先用Ca2+處理細(xì)胞,以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞.

第二步是將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合,在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,完成轉(zhuǎn)化過程.

第二步目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。第四十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二四

目的基因的檢測與鑒定

導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組

DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測1.檢測方法：分子雜交技術(shù)：（1）DNA分子與DNA分子的之間雜交（2）DNA分子與RNA分子的之間雜交（3）蛋白質(zhì)分子（抗原與抗體）之間雜交2.個體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗第四十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法：DNA分子雜交技術(shù)變性變性第四十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期二DNA分子雜交原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補配對進(jìn)行。因此，當(dāng)用探針和轉(zhuǎn)基因生物的DNA雜交時，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置可以看見），則說明目的基因已插入受體細(xì)胞的染色體DNA中?；蛱结槪菏且恍《螁捂湹腄NA或RNA，帶有放