全自動生化分析儀的常用檢測方法

全自動生化分析儀的常用檢測方法第一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)容一概述二基本原理終點法三檢測方法固定時間法連續(xù)監(jiān)測法

第二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二功能特點特點：自動化——機械化的儀器設(shè)備模仿代替手工操作優(yōu)點：提高了工作效率減少了主觀誤差靈敏準確快速標準化第三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二分類管道連續(xù)流動式按結(jié)構(gòu)原理分分立式——常用離心式干片式——急診常用

小型按測定速度分中型大型超大型（模塊式）按自動化程度分半自動全自動第四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)（樣品轉(zhuǎn)盤試劑倉取樣裝置）比色系統(tǒng)（光源比色杯單色器檢測器）供排水系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)容一概述二基本原理終點法三檢測方法固定時間法連續(xù)監(jiān)測法

第六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二基本原理臨床生化分析儀最常使用的是——分光光度法分光光度法——是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。

第七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二分光光度計組成光源樣品池單色器檢測器記錄裝置第八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二光吸收曲線溶液對不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。第九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二討論不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A不同，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。第十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二在分光光度法中,以______為縱坐標,以____為橫坐標作圖可得光吸收曲線。濃度不同的同種溶液,在該種曲線中其最大吸收波長_______，相應(yīng)的吸光度大小則_______，同一波長下摩爾吸數(shù)

。波長不同相同吸光度相同第十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二Lamber-Beer定律：吸收光譜法基本定律描述物質(zhì)對單色光吸收強弱與液層厚度和待測物濃度的關(guān)系Lamber定律：A∝lBeer定律：A∝C

入射光強度I0

透射光強度I

物體截面為S

厚度為l第十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律

當一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，樣品對光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比

A=kcb

A---吸光度k---吸光系數(shù)c---溶液濃度

b---液層厚度第十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二吸光度透光度的負對數(shù)表示物質(zhì)對光的吸收程度

A=-lgT=lg1/T=lgI0/ItT---透光度

I0--入射光強度

It--透射光強度

T=It/I0第十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二吸光系數(shù)

定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。第十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二吸光系數(shù)

三種表現(xiàn)形式：摩爾吸光系數(shù)ε

吸光系數(shù)a

百分吸光系數(shù)E1%1cm第十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律

郎伯-比爾定律表明：當液層厚度固定時，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。即：A/C=const故：只要測出某種溶液的吸光度，將它與已知濃度的標準溶液吸光度進行比較，就可以算出該溶液的濃度。第十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二討論：

1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性如果溶液中同時存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì)

,則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物質(zhì)吸光度的總和，即：

A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac應(yīng)用：多組分測定第十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二偏離Beer定律的因素依據(jù)Beer定律,A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點的直線偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個方面：（一）光學(xué)因素（二）化學(xué)因素

第十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二（一）光學(xué)因素1．非單色光的影響：Beer定律應(yīng)用的重前提—入射光為單色光

照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度第二十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二討論

入射光的譜帶寬度嚴重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀

E1＝E2A=E1C·L

E1≠E2A與C不成線性關(guān)系，偏離Beer定律（E2-E1)↑A與C偏離線性關(guān)系越嚴重結(jié)論：

●選擇較純單色光（Δλ↓，單色性↑）

●選λmax作為測定波長第二十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二（一）光學(xué)因素2.雜散光的影響雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠。雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值。第二十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二（一）光學(xué)因素3．反射光和散色光的影響：反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對T產(chǎn)生影響。散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形注：一般可用空白對比校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形第二十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二（二）化學(xué)因素溶液中的溶質(zhì)可因c的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離L-B定律的現(xiàn)象。例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的兩種離子存在如下平衡

Cr2O42-+H2O?2CrO42-+2H+

第二十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二定量分析方法(1)標準曲線法(2)標準溶液對比法（外標一點法）(3)吸光系數(shù)法第二十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二標準曲線法——最經(jīng)典方法

前提：固定儀器和固定條件

過程：配置標準溶液系列分別測定A

得C~A曲線樣品測定A樣查得C樣第二十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二標準曲線法第二十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二標準溶液對比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標準溶液和濃度為cx的試樣溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax

，依據(jù)朗伯-比爾定律得:

As=KbcsAx=Kbcx

則:cx=cs*Ax/As第二十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二標準溶液對比法第二十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達式A＝Kbc進行計算的定量分析方法。在手冊中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長處的吸光系數(shù)或,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為：或第三十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)容一概述二基本原理終點法三檢測方法固定時間法連續(xù)監(jiān)測法第三十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二終點法終點法——通過檢測終點吸光度的改變大小來求出被測物含量。何為終點？如何判斷？通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)選擇兩個吸光度值，求其平均值，根據(jù)兩點的差值來判斷反應(yīng)終點。第三十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二終點法終點時間的確認：一、根據(jù)時間-吸光度曲線如:Trinder反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘時其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點。二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定如:溴甲酚綠法測血清白蛋白第三十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二分類終點法：一點終點法二點終點法免疫比濁法雙波長法第三十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二一點終點法一點終點法——在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時，選擇一個時間點測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)讀兩個吸光度，求出兩點的平均值，并根據(jù)兩點的差值判斷反應(yīng)是否達到平衡。第三十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二一點終點法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)達到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準曲線通過零點且成直線，對于反應(yīng)速度快的多用。如：GLUTGCH等第三十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二2023/6/837Al

T（時間）AS+R(吸光度）一點終點法反應(yīng)曲線第三十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二計算公式：

C=(Am-Ab)*KAm----終點讀數(shù)點的吸光度

Ab----試劑空白吸光度

K----校正系數(shù)第三十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二二點終點法

第二試劑加入以前，選擇某一點讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時間后反應(yīng)達終點后測第二個吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計算結(jié)果。第一點吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。第三十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二2023/6/840AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時間）兩點終點Ax=樣本空白An-k0

Am（體積校正因子）k0

=Sv+RlSv+R1+R2第四十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二兩點終點法計算公式：

C=(An-K0*Am)*K

K0---體積校正因子K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)第四十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二免疫比濁法

通過物質(zhì)對光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的方法：散射比濁：特定蛋白分析儀透射比濁：自動生化分析儀通常作兩點終點法分析，多采用多點校準。應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab過量，此時Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射射強度與抗原量成正比。第四十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二免疫比濁法優(yōu)點：方法簡便結(jié)果準確可用于自動化儀器檢測缺點：抗體用量大達平衡時間長第四十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二雙波長法

消除樣品中對測定有干擾的物質(zhì)的影響；在試樣中含有兩個組分a和b時，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長λ1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ2，使組分a在這兩個波長處的吸光度相等。第四十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二雙波長法試樣溶液在λ2和λ1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)第四十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300～600nm呈下降趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.膽紅素：300～500nm有吸收峰可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。第四十六頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二雙波長法主波長的選擇

反應(yīng)體系中待測組分吸收峰對應(yīng)的波長，盡量避開或減少來自試劑空白和樣本空白對測定組分的干擾，提高特異性和靈敏度。第四十七頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二雙波長法輔助波長的選擇：根據(jù)測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測定波長同輔助波長有相同的吸光度，待測物吸光度差異很大。如:鉬酸銨法測P3＋用340nm，而Hb在340及380nm均有較高吸收峰，選380nm作為輔助波長。第四十八頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二雙波長法雙波長測定優(yōu)點：①消除噪音干擾②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收的干擾第四十九頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二固定時間法指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，這兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，利用這兩點吸光度差值計算結(jié)果。如：苦味酸法測肌酐第五十頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二固定時間法計算公式：

C=(A2-A1)*K

·●●A1A2T(吸光度）第五十一頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二連續(xù)監(jiān)測法根據(jù)反應(yīng)速度與待測物的濃度成正比，通過測定一段時間內(nèi)吸光度的變化速率（△A/min）來計算待測物的濃度。酶活性測定常用第五十二頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二酶促反應(yīng)曲線第五十三頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二連續(xù)監(jiān)測法零級反應(yīng)期---酶促反應(yīng)速度達到并保持恒定速率進行反應(yīng)，單位時間內(nèi)的變化速率恒定不變。在零級反應(yīng)期單位時間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/min)與酶活力呈正比。第五十四頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二連續(xù)監(jiān)測法測定時間的選擇：監(jiān)測時間應(yīng)根據(jù)所用儀器不影響檢測速度和結(jié)果的準確性選在時間反應(yīng)進程曲線的線性期。通常：延遲時間：30-60秒監(jiān)測時間：>120秒第五十五頁，共六十六頁，編輯于2023年，星期二1.連續(xù)監(jiān)測法

即零級反應(yīng)速率法,亦稱斜率法在較長反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時間(5~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點，得到3個以上