幽門螺桿菌IgG抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制

幽門螺桿菌IgG抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制【摘要】目的建立一種快速檢測抗IgG抗體的膠體金免疫層析試紙條，并優(yōu)化制備中各關(guān)鍵步驟的實驗條件。方法以檸檬酸三鈉還原法制備20nm的膠體金溶液，葡萄球菌A蛋白，制備免疫膠體金復(fù)合物，組裝膠體金免疫層析快速診斷試紙條。結(jié)果用檸檬酸還原法制備的20nm膠體金溶液呈亮紅色。膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度5μg/ml，最適穩(wěn)定量為6μg/ml。SPA標(biāo)記的最適pH為。以此試紙條檢測臨床血清標(biāo)本與進(jìn)口ELISA試劑盒比較，組間陽性率比較差異無顯著性。結(jié)論膠體金免疫層析試紙條質(zhì)量穩(wěn)定性不但與抗原抗體的選擇、用量優(yōu)化、層析材料的選擇、膠體金的制備與標(biāo)記等因素密切相關(guān)，而且緩沖系統(tǒng)的優(yōu)化、輔助添加劑的選擇與優(yōu)化組合也非常重要。

【關(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；膠體金；免疫層析檢測

ResearchondevelopmentofgoldimmunochromatographictestkitforserumantibodyIgG

【Abstract】ObjectiveDevelopinggoldimmunochromatographictestkitforserumantibodyIgGandoptimizethekeyexperimentPreparingthecolloidgoldparticlesof20nmwhichwerecoupledwithStreptococcusproteinA(SPA)，setupthegoldimmunochromatographytestkitforserumantibodyThespheroidalcolloidgoldparticlesof20nmisshownincolorofbrightminimalstableconcentration(MSC)ofgold-SPAis5μg/ml，andthesuitablestableconcentration(SSC)is6μg/pHisappropriate.53serasamplesweretestedbyGICAandELISA，thereisonsignificantdifferencebetweentwoThequalityofgoldimmunochromatographytestkitisassociatedwiththefactors，suchasthequalityandquantityofantigenorantibody，colloidgoldparticles，buffers，etc.

【Keywords】helicobacterpylori;colloidgold;goldimmunochromatographicassay

在幽門螺桿菌感染的診斷中，細(xì)菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、尿素酶試驗、呼氣試驗等方法或因為給患者造成的侵入性痛苦，或需要一定的條件和技術(shù)，或因為需要特殊儀器，或因為費(fèi)用昂貴等，其臨床推廣及多次重復(fù)追蹤復(fù)查受到限制。而血清學(xué)檢測因其非侵入性、快速、準(zhǔn)確，可同時處理大量標(biāo)本，檢測不同類型的抗體，在臨床檢驗、基礎(chǔ)研究中倍受青睞。20世紀(jì)80年代興起的膠體金免疫層析檢測，操作簡單快捷、結(jié)果清晰易于判斷、無需復(fù)雜的實驗技能和特殊設(shè)備，特別適于基層衛(wèi)生單位使用。本研究預(yù)采用超聲全菌體抗原、葡萄球菌A蛋白抗原，嘗試研制一種根據(jù)雙抗原夾心法檢測原理檢測血清、唾液中抗的IgG抗體的膠體金免疫層析檢測試劑，優(yōu)化膠體金免疫層析快速診斷試紙條研制各關(guān)鍵步驟的實驗條件，為進(jìn)一步研制和開發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1材料

幽門螺桿菌菌種SS1為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所保存；TSB肉湯為DIFCO公司產(chǎn)品；氯金酸，上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；檸檬酸三鈉，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；葡萄球菌A蛋白、牛血清白蛋白，均為Sigma公司產(chǎn)品；聚乙二醇，F(xiàn)LUKA公司產(chǎn)品;以上試劑均為分析純。厭氧培養(yǎng)罐AnaeroPackRectangularJar為三菱化學(xué)公司產(chǎn)品。

2方法

玻璃器皿的清潔

制備膠體金的所用容器均應(yīng)反復(fù)清洗，并硅化處理玻璃容器的內(nèi)表面，最后用MQ超純水沖洗晾干備用。

膠體金顆粒的制備

取1%氯金酸溶液1ml，加99ml超純水成終濃度%的氯金酸溶液，加熱沸騰后，取1%檸檬酸三鈉一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱至溶液由淡黃色轉(zhuǎn)為藍(lán)黑色最終變?yōu)榱良t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱5min，室溫冷卻，補(bǔ)充失水至原體積。

免疫膠體金復(fù)合物的制備

膠體金標(biāo)記蛋白最低穩(wěn)定濃度與最適穩(wěn)定量的確定

目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例：用/L的碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至～，取11支潔凈試管分裝膠體金溶液。將待標(biāo)記蛋白質(zhì)SPA逐級稀釋后，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，混勻；5min后，在上述各管內(nèi)分別加入10%氯化鈉溶液，混勻，室溫靜置。依表1順序進(jìn)行。表1膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度實驗

(1)室溫靜置2h以上觀察結(jié)果；(2)未加SPA的11號管為對照管；1號管既不加SPA也不加氯化鈉溶液同樣設(shè)為對照；(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的試管則保持膠體金的紅色不變。以此使膠體金紅色不變而蛋白質(zhì)含量最低的試管的蛋白量，即為穩(wěn)定1ml膠體金的必需蛋白量，也即最低穩(wěn)定量。在此基礎(chǔ)上再加20%即為穩(wěn)定1ml膠體金所需蛋白質(zhì)的實際最適用量。

最適標(biāo)記pH的確定

調(diào)節(jié)膠體金溶液pH依次為4、、、、、、、、、、、、，配合上述最低穩(wěn)定量實驗，確定標(biāo)記蛋白的最佳標(biāo)記pH。

SPA標(biāo)記膠體金

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟按最低穩(wěn)定量的120%計算出所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。在磁力攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中，加入蛋白質(zhì)時應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。分別取1ml膠體金-SPA結(jié)合物液和1ml膠體金原液于試管中加10%氯化鈉溶液，室溫靜置1h，觀察結(jié)果：如果對照組試管溶液由紅色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，甚至可以看到聚合物沉淀，而實驗組溶液仍保持紅色，無沉淀，方可繼續(xù)下一步實驗，否則需補(bǔ)加標(biāo)記用蛋白SPA。最后加入終濃度為%的聚乙二醇，繼續(xù)攪拌30min。

膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的純化

超速離心法純化免疫膠體金復(fù)合物。先以3500rpm離心20min，棄沉淀將上清以13500rpm離心35min，棄上清，用保存液懸起較疏松的紅色沉積物；再以11000rpm離心35min，小心移棄上清后，用保存液懸起較疏松的紅色沉積物至原體積1/10，即為初步純化的免疫膠體金復(fù)合物。

膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的檢定

定量測定：以保存液作對照測530nm處OD值，4℃避光保存。質(zhì)量鑒定：用有Formvar膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾負(fù)染，在Tecnai10透射電鏡下觀察。

金標(biāo)墊的制備

免疫膠體金復(fù)合物稀釋度的確定

純化的膠體金標(biāo)記SPA作不同程度稀釋后，均勻等量浸于同樣大小的玻璃纖維素膜制成金標(biāo)墊。組裝試紙條，在其他條件不變的情況下，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果，確定達(dá)到試紙條敏感度要求的最適膠體金標(biāo)記SPA的稀釋度，或稱為工作濃度。

金標(biāo)墊的制備

保存液稀釋膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物原液至工作濃度，按比例均勻浸于玻璃纖維素膜，-20℃凍存，冷凍真空干燥后，密封保存。

全菌超聲粉碎抗原的制備［1］

幽門螺桿菌SS1采用TSB固體斜面培養(yǎng)基微需氧37℃培養(yǎng)，72h后

轉(zhuǎn)種TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60h后收集菌體。菌體用小體積生理鹽水懸浮，冰浴條件下超聲粉碎有效時間5min，超聲粉碎置顯微鏡下觀察呈均勻細(xì)顆粒狀；4℃，12000r/min離心20min，收集上清；細(xì)菌沉渣再重復(fù)超聲5min，重復(fù)離心過程取上清；合并2次上清，于/L的PB緩沖液中透析24h，中間換液3次，最后12000r/min離心20min，上清測蛋白濃度后分裝，于-20℃保存。

配體固相硝酸纖維素膜的制備

抗原室溫融化后，12000r/min離心10min，取上清2mg/ml用/L的PB緩沖液以250μg/ml間隔，經(jīng)BIO-DOT型XYZ3000點樣儀dispenser線形包被于硝酸纖維素膜的觀察結(jié)果的測試反應(yīng)區(qū)，定義為檢測帶，距離檢測帶5mm遠(yuǎn)的質(zhì)控帶用dispenser線形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存。

樣品墊的處理

選擇適當(dāng)?shù)姆忾]試劑、表面活性劑和(或)非離子型去污劑單獨(dú)或以適當(dāng)比例組合后均勻浸于玻璃纖維素膜，室溫干燥備用。

試紙條組裝

根據(jù)功能不同可將試紙條分為四個部分：上段為手持部位，中段為實驗反應(yīng)區(qū)，下段為樣品區(qū)，在中下段之間放置浸有膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的金標(biāo)墊；而整個試紙條貼附于雙面膠白色塑料背板。

3臨床血清標(biāo)本抗體IgG檢測

取1998年3月～2001年9月期間在我院消化門診就診，臨床診斷為幽門螺桿菌胃炎患兒血清53份。加入80μl于試紙條樣品區(qū)，2～5min開始觀察結(jié)果，20min觀察終止。出現(xiàn)1條紅色沉淀線，為血清學(xué)診斷陰性；出現(xiàn)2條紅色沉淀線，為血清學(xué)診斷陽性。同時采用華美生物工程公司ELISA試劑盒對血清標(biāo)本進(jìn)行對照檢測。組間陽性率采用U檢驗分析。

2實驗結(jié)果

膠體金顆粒制備

我們實驗所用檸檬酸還原法制備的20nm膠體金溶液呈亮紅色，用預(yù)先處理好的覆有Formvar膜的鎳網(wǎng)浸膠體金后在透射電鏡下觀察，可見金顆粒大小基本一致，分布均勻，圓形。測量100個膠體金顆粒直徑，計算平均直徑約20nm。

膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定濃度、最適穩(wěn)定量及最適pH

加入不同濃度SPA的膠體金溶液在加入氯化鈉后呈現(xiàn)不同顏色，使膠體金溶液紅色不變而蛋白質(zhì)含量最低的試管中加入5μgSPA，因此確定本次制備的20nm膠體金標(biāo)記SPA的最低穩(wěn)定量是每毫升膠體金溶液5μgSPA，最適穩(wěn)定量為每毫升膠體金溶液6μgSPA。膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，實驗證實SPA標(biāo)記的最適pH為，符合理論預(yù)測。

膠體金標(biāo)記SPA復(fù)合物的制備與純化

將膠體金溶液pH值調(diào)至，30ml膠體金溶液在磁力攪拌下緩緩加入180μlSPA溶液，加入PEG20000增加膠體金溶液的穩(wěn)定性，超速離心純化后在Tecnai10透射電鏡下觀察，可見金顆粒外圍有明顯的低電子密度暈圈，表明金顆粒表面吸附有蛋白。

臨床血清標(biāo)本抗體IgG檢測結(jié)果

53份受檢血清中抗Hp血清抗體IgG膠體金法陽性21份，疑似7份，陰性25份；ELISA法陽性19份，疑似6份，陰性28份。組間陽性率比較差異無顯著性。表3兩種方法檢測臨床血清標(biāo)本抗體IgG結(jié)果比較

3討論

膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。膠體金的制備并不難，但要制備高質(zhì)量的膠體金卻并非易事，通過反復(fù)實驗我們總結(jié)出如下經(jīng)驗：(1)所用化學(xué)試劑應(yīng)為分析純試劑，試劑質(zhì)量直接影響膠體金制備的成功與否；(2)配制溶液用水應(yīng)為雙蒸水或MQ超純水，而且必須注意到不同來源的水其pH和離子強(qiáng)度有很大差異；(3)玻璃器皿的清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無色或混濁不透明。合格膠體金溶液應(yīng)清亮透明，若混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備膠體金有較多凝集顆粒。膠體金粒子大小不同，顏色亦不同［2］：5～20nm之間，呈葡萄酒紅色；20～40nm之間液體為深紅色；60nm金溶液呈紫紅色，日光下仔細(xì)觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計制得金顆粒大小。不同大小的膠體金粒子具有不同的光散射作用，據(jù)此可用可見光光譜法評價膠體金的粒徑及分布［3］。

鑒定膠體金最有說服力的是在透射電鏡下觀察，理想的金顆粒是大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。拍片放大后測量金顆粒直徑，符合制備要求。小顆粒膠體金基本是圓球形，30～80nm金顆粒則多為偏心圓形［2］。如果金顆粒大小不等或有橢圓形、三角形金顆粒存在應(yīng)重新制備，造成這種情況的主要原因一般與在加還原劑時沒有迅速一次性加入以及攪拌不均勻有關(guān)；此外制備量的多少、容器的大小、加熱的時間等也影響膠體金顆粒的大小。制備好的膠體金可因電解質(zhì)、溫度、金溶液的濃度變化而有不穩(wěn)定和聚沉。因此，制備后最好在20天以內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記，室溫或4℃保存，避免低溫凍存。實驗中我們選擇添加牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑以維持膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長期保存，并防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。牛血清白蛋白、PEG20000是最為常用的高分子穩(wěn)定劑［4］。

膠體金顆粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合一般通過靜電感應(yīng)、蛋白質(zhì)疏水作用吸附于金顆粒表面，或通過蛋白質(zhì)中半胱氨酸的硫殘基與金顆粒的電子層發(fā)生配位結(jié)合［5］。無論其作用機(jī)制為何，環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響吸附的主要因素，一般只有在蛋白質(zhì)等電點略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須用/L碳酸鉀溶液或鹽酸將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點略偏堿。由于膠體金會阻塞pH計電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，用精密的pH試紙測定其pH即可。

標(biāo)記好的免疫膠體金純化處理的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)、未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過程中可能形成的各種聚合物。根據(jù)膠體金顆粒大小不同和所標(biāo)記蛋白質(zhì)的特性不同，選擇并調(diào)整離心轉(zhuǎn)速和離心時間可以達(dá)到一般的純化目的。如有需要可將上述初步純化