植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建課件

植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建1內(nèi)容一植物基因工程載體的種類和特征二根癌農(nóng)桿TI質(zhì)粒三T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能四T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制五植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)六發(fā)根家桿菌的RI質(zhì)粒七無選擇標(biāo)記基因植物轉(zhuǎn)內(nèi)容一植物基因工程載體的種類和特征2笫一節(jié)植物基因工程載體的種類和特征生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化非載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物載體介導(dǎo)的遺傳化根據(jù)截體的不同可以分為病毒載體和質(zhì)粒載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.笫一節(jié)植物基因工程載體的種類和特征生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化3植物轉(zhuǎn)化基因的功能:一它能作為媒介將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中去,并且整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA上.二它能提供被寄主細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識(shí)別的DNA序列,即啟動(dòng)子和復(fù)制子起始點(diǎn)位點(diǎn),以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá).植物轉(zhuǎn)化基因的功能:一二4一病毒載體1.單鏈的RNA植物病毒2.單鏈的DNA植物病毒3.雙鏈的DNA植物病毒以其優(yōu)點(diǎn)如下;植物病毒載體能把外源基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞,并且系統(tǒng)地分布到整個(gè)植株,無需經(jīng)過從原生質(zhì)體再生植株的過程,簡(jiǎn)化了植物基因工程中外源基因的傳遞過程.一病毒載體1.單鏈的RNA植物病毒5

病毒具有較高的自我復(fù)制能力,在轉(zhuǎn)化植物中可以得到高拷貝的外源基因,有利于外源基因的表達(dá)和功能的實(shí)現(xiàn),可以產(chǎn)生大量的外源蛋白質(zhì).

植物病毒載體感染植物后,病毒載體的DNA一般不整合到植物細(xì)胞核DNA上,不影響植物基因組的其他功能基因的表達(dá).病毒具有較高的自我復(fù)制能力,在轉(zhuǎn)化植物中可以得到高拷貝的6植物基因工程病毒載體存在的缺陷:病毒載體不能把攜帶的外源基因整合到寄主染色體上,不能按孟德爾規(guī)律傳遞給后代;病毒載體仍然存在致病的可能性,可能會(huì)誘發(fā)植物產(chǎn)生病害;病毒載體本身的不穩(wěn)定性,病毒載體中的外源基因很容易丟失;病毒基因組發(fā)生突變的頻率也很高.植物基因工程病毒載體存在的缺陷:病毒載體不能把攜帶的外源基因7二質(zhì)粒載體格蘭陰性菌土壤桿菌屬(特征是能夠誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤)根瘤菌屬在根瘤土壤桿菌中,決定冠癭病的質(zhì)粒TI質(zhì)粒,在毛根土壤桿菌中,決定毛根癥的質(zhì)粒為RI質(zhì)粒.它們能引起植物細(xì)胞產(chǎn)生病癥外,還是理想的基因克隆載體.通過它們可以將外源的DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞,并再生出能夠表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物.二質(zhì)粒載體格蘭陰性菌8

笫二節(jié)根癌農(nóng)桿菌TI質(zhì)粒TI質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì),為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子,約有150200KB.章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素堿型(琥珀堿型)笫二節(jié)根癌農(nóng)桿菌TI質(zhì)粒TI質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色9在章魚堿和胭脂堿型TI質(zhì)粒DNA分子中,都含有控制腫瘤誘發(fā)的兩種基因區(qū)段:T區(qū)段~在腫癌形成期間,從根瘤土壤桿菌的TI質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的DNQ片段,約為23KB.和毒性區(qū)段~在細(xì)菌中表達(dá)的數(shù)個(gè)致瘤基因,與T區(qū)段從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳有關(guān).在章魚堿和胭脂堿型TI質(zhì)粒DNA分子中,都含有控制腫瘤誘發(fā)的10一TI質(zhì)粒的有關(guān)結(jié)構(gòu)T—DNA:是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),從TI質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA.VIR區(qū):VIR上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞遺傳過程有關(guān),能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)毒性.CON區(qū):冠癭堿能激活TRA基因,誘導(dǎo)TI質(zhì)粒轉(zhuǎn)移.ORI區(qū);調(diào)控TI質(zhì)粒的自我復(fù)制,故稱復(fù)制起始區(qū)一TI質(zhì)粒的有關(guān)結(jié)構(gòu)T—DNA:是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),11從植物冠癭瘤細(xì)胞中分別分離核DNA,葉綠體DNA,線粒體DNA進(jìn)行分子雜交證實(shí)T-DNA僅存在于細(xì)胞核中.大小在23KB左右,都含有一段8KB左右的核心區(qū).胭脂堿T-DNA是一條約23KB的連續(xù)DNA片段,兩端各有一段25BP的重復(fù)序列,編碼13個(gè)基因.章魚堿T-DNA由兩條分離T-DNA片段組成,各自帶有相應(yīng)的左邊序列和右邊界序列.長(zhǎng)約14DB,攜帶8個(gè)基因,包括章魚堿合成酶基因和致瘤基因.從植物冠癭瘤細(xì)胞中分別分離核DNA,葉綠體DNA,線粒體DN12T-DNA兩個(gè)重要特性保留T-DNA兩端的末端序列,然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物細(xì)胞的致瘤基因除去,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力.毒性區(qū)對(duì)T-DNA的作用既可以以順式作用進(jìn)行,又可以以反式進(jìn)行,T-DNA兩個(gè)重要特性保留T-DNA兩端的末端序列,然后用一13VIR區(qū)VIR區(qū)段總長(zhǎng)度大約35KB,由7個(gè)互補(bǔ)群組成,分別為VIRA,VIRB,VIRC,VIRD,VIRE,VIRG,VIRH.毒性區(qū)有兩種情況:一種是組成性表達(dá),即在無植物誘導(dǎo)分子存在下依然保持一定的表達(dá)水平.一種是植物誘導(dǎo)性表達(dá),即這些基因的表達(dá)必須在土壤農(nóng)桿菌感染植物受傷組織時(shí),植物細(xì)胞分泌的信號(hào)分子作用下才能啟動(dòng)表達(dá).VIR區(qū)VIR區(qū)段總長(zhǎng)度大約35KB,由7個(gè)互補(bǔ)群組成,14下面對(duì)各VIR基因的性質(zhì),功能及作用機(jī)制進(jìn)行闡述VIRA:由單一基因所組成,大小為2.8KB,編碼1條92KDA的多肽.VIR基因所編碼的蛋白質(zhì)與一些細(xì)菌中起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的基因產(chǎn)物有很高的同源性.功能:是幫助植物細(xì)胞接受植物信號(hào)分子,然后啟動(dòng)毒性區(qū)表達(dá).VIRG:小于VIRA,只有1.2KB,為單拷貝基因,只能編碼一條多肽,即DNA結(jié)合化蛋白,下面對(duì)各VIR基因的性質(zhì),功能及作用機(jī)制進(jìn)行闡述VIRA:15VIRG的調(diào)節(jié)方式有兩種形式:它的全誘導(dǎo)表達(dá)需要正常功能的完整VIRA和VIRG基因存在.依賴于自身編碼的VIRG蛋白.在乙酰丁香酮存在時(shí),野生型菌株的VIRG可以由低PH和磷酸饑餓誘導(dǎo)而低水平表達(dá).VIRG的轉(zhuǎn)錄方向是從左到右的,最初的翻譯起始位點(diǎn)只能是48-50位的VIRG.VIRG作為一種DNA結(jié)合蛋白,可以結(jié)合到VIRB,C,D,E,G和H操縱的5’端非轉(zhuǎn)錄區(qū).VIRG的調(diào)節(jié)方式有兩種形式:它的全誘導(dǎo)表達(dá)需要正常功能的完16VIRD:包括4個(gè)開放閱讀框架,分別編碼分子質(zhì)量約為16.2,47.4,21.3,和75.8KDA的四種不同的蛋白分子.VIRD1編碼一個(gè)DNA松弛酶,這種酶與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用類似,它先在DNA鏈上切割一個(gè)缺刻,使DNA解旋后再封閉,降低了DNA超螺旋數(shù)目.VIRB:有兩種信號(hào)肽序列:一種與細(xì)菌輸出信號(hào)肽序列相似.另一種信號(hào)序列屬于脂蛋白信號(hào)序列.VIRC:是毒性區(qū)各位點(diǎn)惟一以反針方向轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn),含有兩個(gè)開放閱讀框架VIRC1和VIRC2,分別編碼1個(gè)約25KDA的蛋白質(zhì)和個(gè)約22KDA的蛋白質(zhì).VIRH:對(duì)植物產(chǎn)生的某些殺菌或者抑菌化合物起解毒作用.VIRD:包括4個(gè)開放閱讀框架,分別編碼分子質(zhì)量約為16.217TI質(zhì)粒的生物學(xué)功能控制冠癭堿的新陳代謝以TI質(zhì)粒為媒介進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移TI質(zhì)粒的生物學(xué)功能控制冠癭堿的新陳代謝18笫三節(jié)T–DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能一T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)二T-DNA的編碼基因及功能笫三節(jié)T–DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能一T-DNA的結(jié)構(gòu)特19T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)TI-質(zhì)粒的T-DNA分子J單拷貝或者是多拷貝的形式隨機(jī)地整合在植物核基因組DNA的位子.整合的胭脂堿T-DNA分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單.單一片段形式存在.整合的章魚堿T-DNA分子人結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜.有兩片段形式.左側(cè)區(qū)段具有控制冠癭瘤形成的基因,右側(cè)區(qū)段參與冠癭瘤堿生物合成的蛋白酶的編碼的基因.章魚堿和胭脂堿TI質(zhì)粒之間,邊緣區(qū)序列相當(dāng)保守.T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)TI-質(zhì)粒的T-DNA分子J單拷貝或者是20T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)植物冠癭瘤的誘發(fā)并非是由整個(gè)TI質(zhì)粒的侵染所致.它的形成是由T-DNA的3個(gè)基因:IAAM,IAAH,IPT.在T-DNA的5’端和3’都有真核表達(dá)信號(hào),如TATA-BOX,AATAA-BOX等.分為左邊界(BL和TL),右邊界(BR和TR)T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)植物冠癭瘤的誘發(fā)并非是由整個(gè)TI質(zhì)粒的侵21T-DNA上的編碼基因及功能科學(xué)發(fā)現(xiàn)T-DNA的編碼基因很有可能是進(jìn)化中補(bǔ)TI質(zhì)粒鋪獲的真核基因．為此，ＯＣＳ和ＮＯＳ基因的啟動(dòng)因子，在各種不同的植物中都有功能活性．在Ｔ－ＤＮＡ區(qū)中引入轉(zhuǎn)座子，使特定的基因發(fā)生突變，突變后的腫瘤細(xì)胞中Ｔ－ＤＮＡ的１個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物隨之消失．基因突變后不能轉(zhuǎn)錄出它所編碼的ＭＲＮＡ，這時(shí)可觀察到帶有突變基因的Ｔ－ＤＮＡ的植物細(xì)胞的表型，從而確定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能．用編碼冠癭堿合成酶及分解借調(diào)基因和誘發(fā)腫瘤的基因證明了編碼兩類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因序列．T-DNA上的編碼基因及功能科學(xué)發(fā)現(xiàn)T-DNA的編碼基因很有22Ｔ－ＮＡ上的編碼基因及功能１．ＡＵＸ基因突變將阻斷腫瘤形成，細(xì)胞生長(zhǎng)素的大量合成，使細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值升高．２ＴＭＳ和ＡＵＸ基因的表達(dá)，使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞內(nèi)激素平衡紊亂，冠癭瘤細(xì)胞無限生長(zhǎng)，形成激素自主性性，引起癌變．Ｔ－ＮＡ上的編碼基因及功能１．ＡＵＸ基因突變將阻斷腫瘤形成，23笫四節(jié)Ｔ－ＤＮＡ轉(zhuǎn)移的機(jī)制T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的,插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn):1.T-DNA優(yōu)先整全到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn);2.T-DNA與植物DNA連接處富含A,T堿基對(duì);3.植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程序的同源性.笫四節(jié)Ｔ－ＤＮＡ轉(zhuǎn)移的機(jī)制T-DNA在植物染色體中的插入是24T-DNA轉(zhuǎn)移的模型和過程DSBR模型基本過程:首先是植物靶DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂,解旋的靶DNA與雙鏈T-DNA退火;單鏈部分被3’-5’外切酶或修復(fù)系統(tǒng)中單鏈特異的核酸內(nèi)切酶去除;然后進(jìn)行修復(fù)連接,并由此導(dǎo)致了DNA的整合和缺失,靶DNA和T-DNA缺失程度由靶DNA與T-DNA互補(bǔ)順序位置所決定.SSGR模型:1.在靶DNA上形成一個(gè)缺刻,然后由于部分解旋或5’-3’外切酶消化形成缺口.2.單鏈T-DNA靠近缺口,由于兩鏈存在短的DNA互補(bǔ)順序,于是退火形成異質(zhì)雙鏈.3.T鏈未配對(duì)的5’-3’單鏈斷部分被除去,T-DNA末端與靶DNA連接.4.在靶DNA鏈的互補(bǔ)鏈產(chǎn)生缺刻,以游離的T-DNA末端為引物修復(fù)合成笫二條T-DNA.T-DNA轉(zhuǎn)移的模型和過程DSBR模型基本過程:SSGR模型25T-DNA整合的機(jī)制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和VIRE基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)受植物信號(hào)分子.VIRA和VIRG是屬于組成型表達(dá)的基因.目前普遍認(rèn)為T-DNA是以T鏈形式向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移的,而不是T-DNA分子.它們的形成取決于VIRD1入VIRD2兩種蛋白.T-DNA整合的機(jī)制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和26DNA非正常重組1.兩個(gè)基本步驟:DNA末端的生成.DNA末端再連接.2.特點(diǎn):T-DNA瞄準(zhǔn)整合的位點(diǎn)沒有序列特異性.整合部位的植物DNA有小段與T-DNA端點(diǎn)附近域同源的序列.在重組后的結(jié)合可能找到一些額外的核苷酸序列;稱為填充DNA.重組結(jié)合部的靶有少量缺失或存在更大部位的重組.DNA非正常重組1.兩個(gè)基本步驟:DNA末端的生成.DNA末27DNA非正常重組3.基本過程;在植物靶DNA上出現(xiàn)一個(gè)缺刻,隨著解鏈宿主細(xì)胞的5’-3’外切酶活性使缺刻擴(kuò)大成裂口.T-DAN侵入裂口,末端與靶DNA單鏈上的少數(shù)核苷酸配對(duì)形成異源二倍體.T-DNA懸掛在外側(cè)的末端被切割除去,T-DAN與靶末端相連.靶DNA上鏈出現(xiàn)缺口,然后以整合后的T-DNA鏈為模板合成T-DNA的笫二條鏈,從而完成整個(gè)整合過程.DNA非正常重組3.基本過程;28植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建課件29整合時(shí)靶DNA所處的環(huán)境不同可能使T-DNA的整合過程不同;1.當(dāng)T-DNA內(nèi)部與靶DNA同源時(shí),截短的T-DNA的可能遠(yuǎn)離T-DNA末端.2.填充DNA的產(chǎn)生可能有四種情況:來自植物染色體組的另一段DNA序列直接與斷頭相連,片段大小可以從一段很小的寡核苷酸到約300BP長(zhǎng)的岡崎片段.滑動(dòng)錯(cuò)位修復(fù)過程.復(fù)雜填充DNA生成.填充DAN是TI質(zhì)粒左端序列的一段序列.整合時(shí)靶DNA所處的環(huán)境不同可能使T-DNA的整合過程不同;30笫五節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化載體統(tǒng)一以Ti質(zhì)粒為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)二構(gòu)建Ti質(zhì)粒載體的策略

笫五節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化載體統(tǒng)一以Ti質(zhì)粒為基礎(chǔ)的遺傳轉(zhuǎn)化系31１.野生型的Ti質(zhì)粒

它是植物病原細(xì)菌（根癌土壤桿菌）所攜帶的長(zhǎng)度為１８０～２００kb的大質(zhì)粒．Ti質(zhì)粒是植物基因工程的一種天然載體．但野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：①Ti質(zhì)粒分子質(zhì)量過大，一般為１６０～２４０kb，在基因工程中難以操作．②大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)．③T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡．④Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制．⑤Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的冗余基因．１.野生型的Ti質(zhì)粒它是植物病原細(xì)菌（根癌土壤桿菌）所32２.Onc卸甲載體所謂卸甲載體就是無毒的Ti質(zhì)粒載體．在這種Onc載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322區(qū)段所取代。這樣任何適合于克隆在pBR322質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過與pBR322質(zhì)粒DNA的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。２.Onc卸甲載體所謂卸甲載體就是無毒的Ti質(zhì)粒載體33ONC卸甲載體常用的受體Ti卸甲載體有三種：⑴pGV3850載體：是一個(gè)由胭脂堿型Ti質(zhì)粒pTiC58衍生出來的Onc卸甲載體。⑵pG2250載體:也是屬于含pBR交換序列的卸甲載體，但它使pBR322DNA成為一種多用途受體質(zhì)粒．pG2250載體是章魚堿型Ti質(zhì)粒pTiB6S3的衍生質(zhì)粒．它也是被切除了Onc基因的載體．⑶pTiB6S3－SE載體：是由章魚堿型Ti質(zhì)粒衍生的卸甲載體．TR-DNA完全缺失，TL-DNA僅剩BamHI-8的部分片段．其中含有“左側(cè)內(nèi)部同源區(qū)”．ONC卸甲載體常用的受體Ti卸甲載體有三種：343共整合載體系統(tǒng)共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過突變后的TI質(zhì)粒和中間載體的兩部分.共整合系統(tǒng)的特點(diǎn)是具有兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒:農(nóng)桿菌TI質(zhì)粒和大腸桿菌中間載體.這兩個(gè)質(zhì)粒具有一同源區(qū),在農(nóng)桿菌和大腸桿菌接合后經(jīng)過同源重組形成一個(gè)大的共整合質(zhì)粒.隔端載體系統(tǒng)是一種較有效的共整合載體系統(tǒng),它的左右邊界分別位于兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上.3共整合載體系統(tǒng)共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成353共整合載體系統(tǒng)常見的共整合載體質(zhì)粒有以下幾種:PGV3850系統(tǒng)PGV2260系統(tǒng)PMON200系統(tǒng)3共整合載體系統(tǒng)常見的共整合載體質(zhì)粒有以下幾種:364雙元載體系統(tǒng)雙元系統(tǒng)的特點(diǎn):兩個(gè)質(zhì)粒即穿梭質(zhì)粒和TI質(zhì)粒,在接合后可以自主性共存于同一農(nóng)桿菌細(xì)胞中.雙元系統(tǒng)中的農(nóng)桿菌質(zhì)料是一個(gè)經(jīng)過改造的TI質(zhì)粒,具有VIR基因和農(nóng)桿菌復(fù)制起始子,但沒有T-DNA邊界序列.接合合,兩個(gè)質(zhì)粒在選擇壓下可以自主共存于同一農(nóng)桿菌細(xì)胞中.當(dāng)農(nóng)桿菌感染受傷的植物時(shí),TI質(zhì)粒上的VIR基因與穿梭質(zhì)粒上的右邊界序列發(fā)生反式相互作用,從而將T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組,這就是雙元載體系統(tǒng)的特點(diǎn).4雙元載體系統(tǒng)雙元系統(tǒng)的特點(diǎn):374雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)避免了共整合步驟.這種系統(tǒng)需要兩個(gè)基本點(diǎn)彼此分離的質(zhì)粒，一個(gè)多功能克隆載體質(zhì)粒，在大腸桿菌和土壤農(nóng)桿菌中都能夠復(fù)制．它該具備以下三個(gè)特點(diǎn)；在它Ｔ－ＤＮＡ末端序列內(nèi)含有單一克隆位點(diǎn)和植物選擇標(biāo)記基因．Ｔ－ＤＮＡ區(qū)以外含有細(xì)菌選擇標(biāo)記基因，以便選擇轉(zhuǎn)化菌株．可以由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌中．4雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)避免了共整合步驟.這種系統(tǒng)需要兩384雙元載體系統(tǒng)無論是共整合載體系統(tǒng)還是雙元載體系統(tǒng)，把中間載體質(zhì)粒由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到土壤農(nóng)桿菌中都需要三種細(xì)菌參與，稱三親交配法．4雙元載體系統(tǒng)無論是共整合載體系統(tǒng)還是雙元載體系統(tǒng)，把中間39二構(gòu)建ＴＩ質(zhì)粒載體的策略１．中間載體策略基本原理是把Ｔ區(qū)片段克隆到普通載體ＰＢＲ３２２上，把外源基因插入到該Ｔ區(qū)后再導(dǎo)回Ａ，ＴＵＭＥＦＡＣＩＥＮＳ受體細(xì)胞中，使外源ＤＮＡ轉(zhuǎn)移到ＴＩ質(zhì)粒上，再經(jīng)根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物把該外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)．如ＰＧＶ３８５０這種質(zhì)粒載體十分有用，它即能把Ｔ－ＤＮＡ轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞基因組，又不會(huì)使植物產(chǎn)生冠癭瘤，而且由于在其Ｔ－ＤＮＡ中存在著ＰＢＲ３２２的ＤＮＡ序列,使它成為一種通用受體質(zhì)粒.二構(gòu)建ＴＩ質(zhì)粒載體的策略１．中間載體策略402.雙元載體策略在中間載體策略應(yīng)用以后,發(fā)現(xiàn)TI質(zhì)粒上另一簇基因(VIR基因)起著重要作用.T-DNA向植物基因組插入也不是依靠它的全部結(jié)構(gòu),只是T-DNA兩端25bp的反向重復(fù)序列作用的結(jié)果2.雙元載體策略在中間載體策略應(yīng)用以后,發(fā)現(xiàn)TI質(zhì)粒上另一簇412.雙元載體策略雙元TI質(zhì)粒系統(tǒng)的基本特點(diǎn):它由兩個(gè)彼此相容的TI質(zhì)粒組成,其中之一是含有T-DNA轉(zhuǎn)移所必須的VIR區(qū)段的廣寄主范圍的DNA轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒,后者含有T-DNA的質(zhì)粒,由于分子質(zhì)量小,又能夠在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制,因而易于進(jìn)行操作,但不具備誘發(fā)腫瘤的功能.2.雙元載體策略雙元TI質(zhì)粒系統(tǒng)的基本特點(diǎn):422.雙元載體策略雙元載體法是由Hoekema等于1983年首次提出,優(yōu)點(diǎn)在于它不需要構(gòu)建質(zhì)粒共合體.TI質(zhì)粒的寄住范圍主要是雙子葉植物,在單子植物基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用受到了限制.2.雙元載體策略雙元載體法是由Hoekema等于1983年首43嵌合基因的構(gòu)建原核生物的基因在植物中表達(dá)必須首先具備能在植物細(xì)胞中正確,穩(wěn)定表達(dá)的基因調(diào)控序列(5’和3’端的調(diào)控序列),然后再將調(diào)控序列生物基因的結(jié)構(gòu)基因部分按原來方向插入到調(diào)控序列之間.這種調(diào)控序列和結(jié)構(gòu)基因來自兩種或兩種以上的生物的基因稱為嵌合基因.有以下幾類;nos_DHFR,nos_CAT,CAMV35S啟動(dòng)引子和CaMV35S啟動(dòng)子-GUS等.嵌合基因的構(gòu)建原核生物的基因在植物中表達(dá)必須首先具備能在植物44笫六節(jié)發(fā)根農(nóng)桿菌的RI質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌同屬菌科,均為革蘭陰性菌.根癌農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞后誘導(dǎo)冠癭瘤及合成冠癭堿,故稱為瘤誘導(dǎo)TI質(zhì)粒.發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物產(chǎn)生許多不定根,這種不定根生長(zhǎng)迅速,不斷分支成毛狀,故稱毛狀根,也稱發(fā)狀根.RI質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒.與TI質(zhì)粒相比,RI質(zhì)?？梢圆唤?jīng)”解除武裝”進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并且轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的發(fā)根能夠再生植株;每條發(fā)狀根是一個(gè)單細(xì)胞克隆,可以避免嵌合體;RI質(zhì)?？芍苯幼鳛橹虚g載體;RI質(zhì)粒和TI質(zhì)粒可以配合使用建立雙元載體系統(tǒng),拓展了兩類質(zhì)粒在植物基因工程中的應(yīng)用范圍;發(fā)根適于進(jìn)行離休培養(yǎng),而且很多植物的發(fā)根在離體培養(yǎng)條件下都表現(xiàn)出原植物株次生代謝產(chǎn)物的合成能力.可以應(yīng)用于次生代謝物生產(chǎn).笫六節(jié)發(fā)根農(nóng)桿菌的RI質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌同屬菌科45一發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性發(fā)根農(nóng)桿菌是一種寄主非常廣泛的土壤細(xì)菌,能夠侵染幾乎所有的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物.RI質(zhì)粒具有多種形式,可以歸屬兩種生物型菌株:生物型1;黃瓜堿型菌株生物型2;農(nóng)桿堿型和甘露堿型菌株它們