消渴中藥膠囊對dbdb小鼠早期糖尿病視網(wǎng)膜病的治療作用

消渴中藥膠囊對dbdb小鼠早期糖尿病視網(wǎng)膜病的治療作用

截至2017年底，中國約有14000名糖尿病患者，世界上約有第四.25億人患糖尿病。預計糖尿病患者的數(shù)量將比2045年增加到69億。渴絡欣膠囊(KLX)作為國內(nèi)臨床用于糖尿病腎病(微血管病變)治療的復方中藥制劑藥物、試劑與儀器渴絡欣膠囊(批號170301,成都康弘制藥有限公司),羥苯磺酸鈣(批號1612133-1,西安利君制藥有限責任公司),氯化鈉注射液(批號E17030305,山東華魯制藥有限公司),一次性使用無菌溶藥注射器(1mL,批號20160458,江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司),卡波姆滴眼液(批號1946,山東博士倫福瑞達制藥有限公司),復方托吡卡胺滴眼液(批號170102,沈陽興齊眼藥股份有限公司),熒光素鈉注射液(批號277608F,愛爾康眼科公司),戊巴比妥鈉(批號57-33-0,德國Merck),速眠新注射液(批號20161208,吉林省康達動物藥業(yè)有限責任公司),無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司),多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司),PBS(批號ZLI-9061,無錫傲銳東源生物科技有限公司),TritonX-100(批號MKB8708V,美國Sigma公司),BSA(批號SLBJ7347V,美國Sigma公司),H100只6～8周齡雄性自發(fā)性糖尿病小鼠模型C57BL/KsJdb視覺電生理儀(OPTO-Ⅲ),眼科超顯微成像系統(tǒng)ISOCT(Optoprobe,加拿大);視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)OPTO-RIS(OptoproberesearchLTD,加拿大);掃描成像數(shù)據(jù)中心(OptoprobeDN-17,加拿大);羅氏血糖儀活力型(06656919032,瑞士);血糖試紙(07124287),電子天平(YP1001N)(上海菁海儀器有限公司);濕盒(上海協(xié)力塑料制品廠);微波爐(美的集團);石蠟切片機(RM2245,Leica,德國);熒光顯微鏡(DP72型),正置顯微鏡(Olympus,日本);展片機(ZPJ-1A),烤片機(KPJ-1A)(天津天利航空機電有限公司)。方法模型小鼠隨機分組20只同窩野生型小鼠作為①對照組;100只db/db小鼠隨機分組為:②模型組,③～⑤渴絡欣膠囊低、中、高劑量組(780,1560,3120mg·kg小鼠光學相干斷層掃描電泳應用4D組織結(jié)構(gòu)與功能評價系統(tǒng)(Optoprobe,加拿大)進行小鼠光學相干斷層掃描。根據(jù)體質(zhì)量,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.003mL·g顯微鏡下熒光血管成像對大鼠血管和微血管瘤的新血管應用小動物眼功能熒光實時監(jiān)測系統(tǒng)進行小鼠熒光血管造影。根據(jù)體質(zhì)量,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.003mL·g通過視覺電圖測試大鼠的視覺電生理能所有待實驗小鼠提前暗適應12h,根據(jù)體質(zhì)量,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.003mL·g視網(wǎng)膜染色麻醉處死小鼠,摘取眼球,并分離視網(wǎng)膜,固定于眼球?qū)Ｓ霉潭ㄒ骸Ｖ谱魇炃衅?HE染色。正置顯微鏡拍照獲取結(jié)果。網(wǎng)膜的制備麻醉處死小鼠,摘取眼球,并分離視網(wǎng)膜,固定于眼球?qū)Ｓ霉潭ㄒ?。制作石蠟切?根據(jù)試劑盒說明進行免疫組織化學染色。于正置顯微鏡下拍照獲取結(jié)果。統(tǒng)計處理各組數(shù)據(jù)均用結(jié)果渴絡欣膠囊對慢性藥羥苯磺酸鈣組體質(zhì)量及血糖水平的影響連續(xù)灌胃給藥20周后,與模型組比較,渴絡欣膠囊低、中、高劑量組及陽性藥羥苯磺酸鈣組體質(zhì)量及血糖水平?jīng)]有顯著性差異(圖1)。結(jié)果表明,渴絡欣膠囊對渴絡欣膠囊對金經(jīng)節(jié)細胞層厚度的影響連續(xù)灌胃給藥20周后,與對照組相比,模型組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)網(wǎng)狀層厚度顯著降低;與模型組相比,渴絡欣膠囊低、中劑量組能顯著改善神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)網(wǎng)狀層厚度,且顯著優(yōu)于陽性藥羥苯磺酸鈣(圖2)。結(jié)果表明,渴絡欣膠囊對視網(wǎng)膜糖尿病神經(jīng)病變具有顯著治療作用。渴絡欣膠囊對小鼠眼底熒光強度的影響連續(xù)灌胃給藥20周后,與對照組相比,模型組小鼠血管反光增強,串珠樣靜脈擴展,但未見明顯血管滲漏、微血管瘤或血管新生形成;渴絡欣膠囊各劑量組都能顯著減少眼底熒光強度(圖3)。結(jié)果表明,渴絡欣膠囊能夠改善db/db小鼠視網(wǎng)膜早期微血管病變?？式j欣膠囊對小鼠視網(wǎng)膜功能的影響db/db小鼠連續(xù)飼養(yǎng)20周后,與對照組相比,模型組小鼠N1,P1和P2波振幅值顯著降低;同時,渴絡欣膠囊中、高劑量組與模型組N1,P1和P2波振幅值相比具有統(tǒng)計學意義(圖4)。結(jié)果表明,連續(xù)飼養(yǎng)20周后,渴絡欣膠囊能夠顯著改善視網(wǎng)膜功能。db/db小鼠連續(xù)飼養(yǎng)20周后,與對照組相比,模型組小鼠OPs波振幅各波振幅并未出現(xiàn)顯著性差異。同時,渴絡欣膠囊各組與模型組相比也未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(圖5)。結(jié)果表明,連續(xù)飼養(yǎng)20周后糖尿病視網(wǎng)膜血液循環(huán)還未見顯著性變化。小鼠視網(wǎng)膜組織病理學檢測HE染色后,光鏡下觀察可見,對照組視網(wǎng)膜表面光滑,各層形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰完整,細胞排列緊密;db/db小鼠視網(wǎng)膜各層明顯變得模糊、細胞疏松,且各層細胞排列紊亂;渴絡欣膠囊中、高劑量組能夠改善視網(wǎng)膜水腫程度、改善各層細胞排列不規(guī)則(圖6)。結(jié)果表明,渴絡欣膠囊能夠顯著改善db/db糖尿病小鼠早期視網(wǎng)膜病變。模型各組gfap表達的比較與對照組相比,模型組視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表達并未見明顯增加;同時,與模型組比較,KLX各組GFAP的表達也無顯著變化(圖7)。免疫組化結(jié)果表明,連續(xù)灌胃20周后,db/db小鼠并未呈現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的膠質(zhì)化特征?？式j欣膠囊對db/db小鼠視網(wǎng)膜血管漏失率的影響近年來,臨床研究表明中醫(yī)藥在治療糖尿病并發(fā)癥中扮演了越來越重要的作用DR是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥,流行病學數(shù)據(jù)表明在中國約有1/3的糖尿病患者將有視網(wǎng)膜病變。雖然近些年糖尿病視網(wǎng)膜病得到了一定的治療,但是隨著患病人數(shù)的逐年遞增,DR仍然是急需解決的醫(yī)學難題。目前臨床主要通過眼底熒光造影進行早期DR的檢測,微血管瘤、出血和硬性滲出作為判斷早期視網(wǎng)膜病的標志本研究結(jié)果顯示,渴絡欣膠囊給藥后對小鼠血糖和體質(zhì)量并未見顯著的調(diào)節(jié)作用。FFA將熒光素鈉作為制影劑,當熒光素鈉進入眼底血管時,通過眼底攝影機對眼底血管進行連續(xù)拍攝,并接收激發(fā)發(fā)射出的熒光,以觀察視網(wǎng)膜動態(tài)輪回的過程,可以精確地分辨眼底病變的部位、反映病變的程度。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)db/db小鼠連續(xù)飼養(yǎng)20周后,并未出現(xiàn)顯著的血管滲漏現(xiàn)象,但渴絡欣膠囊能夠降低視網(wǎng)膜血管的熒光強度,提示渴絡欣膠囊可以緩解DR的進程。OCT能對組織進行活體斷層掃描可以清楚的顯示視網(wǎng)膜各層形態(tài),獲得視網(wǎng)膜內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的橫斷圖像閃光視覺誘發(fā)電位(flashvisualevokedpotential,FVEP)反映視覺信息從視網(wǎng)膜到大腦皮質(zhì)視覺中樞信號的傳遞過程,是視網(wǎng)膜受到光刺激后,神經(jīng)沖動從神經(jīng)節(jié)細胞突觸、軸索、視神經(jīng)到枕葉視皮質(zhì)視覺產(chǎn)生過程中所伴發(fā)的電活動,能敏感地反映視神經(jīng)各區(qū)神經(jīng)元的軸索和髓鞘的完整性及功能狀態(tài)視網(wǎng)膜組織病理檢測能直觀檢測其損傷程度,通過HE實驗證明渴絡欣膠囊能夠改善視網(wǎng)膜細胞排列