第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基

本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第一節(jié)無菌操作技術(shù)第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的觀察第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測主要內(nèi)容第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法教學(xué)目的和要求重點(diǎn)和難點(diǎn)：掌握細(xì)胞培養(yǎng)中無菌操作技術(shù)及操作過程中需要注意哪些問題；預(yù)防污染是無菌操作的關(guān)鍵。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。一切操作需要保證無菌和有條不紊。組織培養(yǎng)中最重要的，也是最基本的要求就是各項(xiàng)操作均應(yīng)從無毒害、無污染的培養(yǎng)環(huán)境來考慮。培養(yǎng)基、器皿材料、接種工具、操作環(huán)境、培養(yǎng)室和超凈工作臺(tái)等各個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)注意。第一節(jié)無菌操作技術(shù)第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、實(shí)驗(yàn)器具等的洗滌和材料的準(zhǔn)備

在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。

第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法培養(yǎng)玻璃器具的洗滌是非常重要的。用完后應(yīng)洗凈，再用蒸餾水沖一遍，烘干；用合適的方法滅菌。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒（一）、無菌與有菌范疇滅菌工作是極其重要的。對(duì)于初學(xué)者來說，首先應(yīng)建立有菌和無菌的概念。有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具、手等。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法無菌的范疇：物理或化學(xué)處理的物體（工具、器皿、培養(yǎng)基等）健康的動(dòng)植物不與外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）經(jīng)過滅菌的物品有可能再次染菌第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（二）無菌操作室

工作前后室內(nèi)清掃、拖地，以防菌在空氣中流動(dòng)，特別真菌孢子。使用前，室內(nèi)及超凈工作臺(tái)紫外燈殺菌30分鐘，超凈工作臺(tái)酒精（75%）殺菌，工作中一直吹風(fēng)。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法三、洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法四、無菌培養(yǎng)操作1、首先點(diǎn)燃酒精燈，所有操作均在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行；冷卻后才能使用；2、操作時(shí)，打開試管蓋，要進(jìn)行燒灼滅菌，但是時(shí)間要短。在火焰上燒瓶口。保證容器傾斜。3、進(jìn)行操作時(shí)動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但是不宜太快，防止空氣流動(dòng)，增加污染的機(jī)會(huì)；第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法4、超凈工作臺(tái)上的器具和用品要擺放合理；5、操作時(shí)器具不能觸及瓶口以防止污染；6、不要說話、咳嗽、打噴嚏等，頭發(fā)、首飾等注意；7、吸管、注射器等專管專用。

接種時(shí)在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中正

確

錯(cuò)

誤

整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正

確

錯(cuò)

誤

防止操作帶來的污染

接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求正

確

錯(cuò)

誤

正

確

錯(cuò)

誤

接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯(cuò)

誤

接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

種子和分生組織：培養(yǎng)時(shí)通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內(nèi)部，以免供氧不足正

確

錯(cuò)

誤

接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中

正

確

錯(cuò)

誤

第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法污染材料應(yīng)及時(shí)清除，高壓滅菌。菌有兩種，細(xì)菌成粘液狀，真菌有菌絲。特別真菌危害極大。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法五、使用超凈臺(tái)注意事項(xiàng)1、超凈臺(tái)安裝在清潔無塵的房間內(nèi)，最好為隔離的無菌間，以免塵土過多易使濾器阻塞，降低凈化效果，縮短使用壽命；第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法2、長期未使用或新安裝的超凈臺(tái)使用前必須對(duì)工作臺(tái)和周圍環(huán)境進(jìn)行清掃，再采用化學(xué)滅菌或紫外線滅菌法進(jìn)行滅菌處理；第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法3、使用前用75％酒精擦洗臺(tái)面，并提前用紫外線滅菌30min。關(guān)閉紫外燈后應(yīng)啟動(dòng)鼓風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)幾分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作；第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法4、凈化工作區(qū)不應(yīng)存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾；5、用后工作臺(tái)要用75％酒精擦洗，以備后面工作人員使用；6、經(jīng)常注意工作區(qū)上方微壓表的指示，及時(shí)更換濾器。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法六、培養(yǎng)細(xì)胞的取材取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運(yùn)送，24h內(nèi)盡快培養(yǎng)。取材無菌操作，避免對(duì)組織的機(jī)械損傷，盡量去除脂肪、神經(jīng)、結(jié)締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同時(shí)保留組織學(xué)和電鏡標(biāo)本，對(duì)供體來源、部位及一般情況做記錄。欲從組織中獲得大量生長良好的細(xì)胞，須將組織分散開，使細(xì)胞解離出來。常用方法有機(jī)械法和化學(xué)法。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞的觀察第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法組織塊培養(yǎng)法將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時(shí)貼壁后，細(xì)胞就從組織周圍長出。培養(yǎng)瓶底預(yù)先涂以膠原薄層，以利上皮細(xì)胞的生長。如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進(jìn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。換液需輕巧，以免組織塊漂起，細(xì)胞死亡第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法消化培養(yǎng)法采用前述的組織消化分散法。將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）

1958年Abercrombie等學(xué)者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細(xì)胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細(xì)胞移動(dòng)而相互靠近，這時(shí)某些細(xì)胞可移向其他方向，保證細(xì)胞不會(huì)重疊，一但接觸，這種活動(dòng)即可停止。所謂接觸抑制實(shí)際使細(xì)胞匯合形成單層時(shí)，細(xì)胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應(yīng)減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機(jī)體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細(xì)胞保持異質(zhì)性，細(xì)胞種類較多，接近原組織細(xì)胞種類。維持時(shí)間，因細(xì)胞種類不同，一般1-4周。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細(xì)胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細(xì)胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時(shí)可發(fā)生染色體丟失、突變、細(xì)胞增殖變慢、停止分裂，進(jìn)入衰退期，我們稱之有限細(xì)胞系。這一轉(zhuǎn)折點(diǎn)有人稱之危象臨界點(diǎn)（crisis）有些細(xì)胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細(xì)胞系，或無限細(xì)胞系，即一般通稱的細(xì)胞系。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法（3）衰退期：傳代細(xì)胞到達(dá)一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進(jìn)而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細(xì)胞（或叫有限細(xì)胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點(diǎn)），導(dǎo)致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學(xué)衰老的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。人胚胎成纖維細(xì)胞可以進(jìn)行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細(xì)胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細(xì)胞壽命4-10天；紅細(xì)胞3周-3個(gè)月，白細(xì)胞5-7天，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)年或更多。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

實(shí)體顯微鏡（解剖鏡）倒置顯微鏡生物顯微鏡照相設(shè)備

對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究2、顯微鏡觀察第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法（cellcounting）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的一種方法。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法4、細(xì)胞生長曲線（cellgrowthcurve）是觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間縱坐標(biāo)為細(xì)胞密度注意：只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細(xì)胞才適合觀察。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞生長曲線細(xì)胞數(shù)量生長天數(shù)緩慢生長期對(duì)數(shù)生長期平衡期第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

（1）遲緩期（或延遲期）當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞逐漸貼附于瓶底，并恢復(fù)貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細(xì)胞分裂及增殖，但生長緩慢。

（2）對(duì)數(shù)生長期：此期幾乎所有的細(xì)胞都在進(jìn)行分裂，細(xì)胞數(shù)目迅速增長。其細(xì)胞倍增時(shí)間（TD）等于細(xì)胞周期時(shí)間（TC）長度。這一期常用細(xì)胞倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細(xì)胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細(xì)胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。

第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法5、細(xì)胞分裂指數(shù)指分裂期細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占的百分率，用以表示細(xì)胞的增殖旺盛程度。一般要計(jì)算和觀察1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法6、細(xì)胞貼壁率細(xì)胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長細(xì)胞，主要反映細(xì)胞的生存能力和部分底物材料的相容性。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法7、細(xì)胞周期

細(xì)胞周期：一個(gè)細(xì)胞的分裂生長周期時(shí)間。

倍增時(shí)間：指在對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)量增加一倍所用的時(shí)間，這一時(shí)間內(nèi)一般有些細(xì)胞參與分裂有些細(xì)胞可能不參與分裂，有些可能分裂兩次或數(shù)次，但細(xì)胞總數(shù)量增加1倍。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法一、活體染色體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即活體染料）對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞的生命活動(dòng)的一種方法。利用這種方法，可以對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色觀察，染色后的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法1、活體染料的類別

堿性染料酸性染料中性紅，甲基蘭剛果紅，臺(tái)盼藍(lán)第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法2、染料排除檢測法第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的污染與檢測污染是組織培養(yǎng)的大敵，避免污染的發(fā)生。污染一般包括微生物污染（細(xì)菌、真菌、支原體和病毒）、化學(xué)物（影響細(xì)胞生存的非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）、細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、污染途徑A.空氣措施：減少空氣流動(dòng)B.器材措施：消毒徹底，洗刷干凈，定期消毒第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法C.操作措施：嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，避免交叉感染D.血清E.組織樣本很難避免第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測影響：細(xì)胞生長緩慢、分裂相減少、細(xì)胞變得粗糙、細(xì)胞輪廓增強(qiáng)、重者細(xì)胞停止增殖、分裂相消失、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物、細(xì)胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法A.細(xì)菌的污染及檢測取懸液培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變黃，混濁。B.真菌的污染及檢測可見菌絲，顯微鏡下可觀察到鏈狀排列的菌珠，散在細(xì)胞周圍和細(xì)胞之間生長。第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法C.支原體污染常見而棘手，與細(xì)胞共存。借助顯微鏡、電鏡、DNA熒光處理法等觀察。D.病毒的污染及檢測

第三章細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法E.細(xì)胞交叉污染及檢測操作不當(dāng)、共同培養(yǎng)導(dǎo)致不同種類之間發(fā)生混亂，細(xì)胞生長特征、形態(tài)發(fā)生變化。有效防止細(xì)胞的交叉污染：1）在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)器具要嚴(yán)格區(qū)分；2）器具