elisa測定結(jié)果常見的影響因素及結(jié)果控制

elisa測定結(jié)果常見的影響因素及結(jié)果控制

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是20世紀(jì)70年代開發(fā)的一種檢測技術(shù)。由于其高度敏感、特異性強(qiáng)、操作簡單，它在各種抗包和抗包試驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用，如輔助臨床診斷和生物科學(xué)研究。但ELISA測定中影響因素較多,操作過程中每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果?，F(xiàn)筆者對(duì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的常見因素及相應(yīng)的控制方法分析探討如下:1試劑的原因1.1elisa試劑使用情況試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關(guān)鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對(duì)ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān),但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購知名度相對(duì)高、具有“三證”的試劑,不要用無批號(hào)的試劑,最好選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號(hào)的試劑。1.2假陰性法的后果在臨床實(shí)驗(yàn)室,對(duì)試劑的準(zhǔn)備一般不太注意,通常的做法是在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用,而忽略了這種做法有可能影響后面時(shí)間不夠的問題,其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此,在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是,將試劑盒先從冰箱中拿出來,在室溫下放置20~30min后,再進(jìn)行測定,使試劑盒在使用前與室溫平衡,這樣做的目的能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所需的溫度,以滿足后面的測定需求。2樣本的要素2.1內(nèi)源性干擾因素包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。2.1.1elisa測定a型的制備方法在類風(fēng)濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風(fēng)濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn),因?yàn)樵贓LISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。避免其發(fā)生的方法有:(1)用F(ab)2替代完整的IgG。(2)標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理。(3)檢測抗原時(shí),可用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解。2.1.2抗體的假陰性在固相酶免疫測定中,來自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。一方面,固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗體分子發(fā)生變構(gòu),使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來,使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面,固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合,封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性。解決的辦法是:(1)用EDTA稀釋標(biāo)本。(2)56℃30min加熱血清使C1q滅活。2.2外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長和標(biāo)本凝固不全等。2.2.1elisa測定血清中血紅蛋白濃度血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性,因此,在以辣根過氧化物酶(HRP)為標(biāo)志的ELISA測定中,如血清樣本中血紅蛋白濃度較高,則很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。所以在采血時(shí)應(yīng)注意手法,采集的血液勿用力振蕩,嚴(yán)防標(biāo)本溶血。2.2.2elisa檢測新鮮標(biāo)本菌體可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,可使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色。因此,ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本,如不能當(dāng)時(shí)測定,5d之內(nèi)應(yīng)4℃保存,1周后檢測應(yīng)低溫凍存;同時(shí),收集標(biāo)本采用無菌試管,可防止標(biāo)本的污染。2.2.3聚體的假陽性標(biāo)本在冰箱中保存過久,血清中IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,在用間接法測定中會(huì)導(dǎo)致本底過深,甚至造成假陽性。冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果。因此,ELISA檢測盡量采用新鮮標(biāo)本,長時(shí)凍存的樣本避免反復(fù)融凍。2.2.4樣品的固定裝置3操作中的要素3.1加酶帶試劑量不確定孵育前加樣時(shí)間過長,酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時(shí),滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準(zhǔn),都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。控制方法:(1)實(shí)驗(yàn)樣本過多時(shí),可分批次操作,以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長造成的誤差;(2)加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑;(3)作定量試驗(yàn)時(shí),使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,此外,要做到一份樣本一個(gè)移液頭,防止交叉污染。3.2溫育溫度和溫室溫育是ELISA測定最為關(guān)鍵、最容易出現(xiàn)問題的步驟。最為常見的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2~8℃。目前國內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時(shí)間為37℃,30min~1h,進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃,1~2h能有較完全的結(jié)合。3.2.2外周血孔顯色法“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中,外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。3.3抽吸不完全,清洗不規(guī)范ELISA測定的洗板一般有兩種方式,即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板,孔與孔之間液體易交叉,采用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí),洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底,洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全,洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差。控制方法:(1)手工洗板時(shí),拍板時(shí)要垂直,避免交叉污染,用力不能過猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離;(2)洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢,若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出;(3)為了洗滌效果好,實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1~2次,或適當(dāng)增加洗板的次數(shù),有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。3.4鄰苯二胺opd為底物的試劑市售ELISA試劑盒中,如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物,則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液;如以鄰苯二胺(OPD)為底物,則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15~30min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑,要臨用前30min配制且必須避光。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光,但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。3.5elisa法讀取結(jié)果要在15~30min內(nèi)完成,定性測定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí),反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10~15cm;定量測定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果,酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強(qiáng)光照射下,需先預(yù)熱15~30min再進(jìn)行測試。綜上所述,盡管ELISA法操作簡單,但可能影響測定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過程中,要加強(qiáng)質(zhì)量管理,認(rèn)真避免或減少影響因素,力求結(jié)果準(zhǔn)確,為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽性。解決的方法有:(1)于采血管中加入適當(dāng)?shù)目鼓齽?(2)將采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1h,待充分凝固后再離心分離血清。3.2.1孔內(nèi)溫度出現(xiàn)構(gòu)想一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完樣本和(或)試劑后將微孔