維生素e和維生素c聯(lián)合染毒對慢性鎘中毒小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用

維生素e和維生素c聯(lián)合染毒對慢性鎘中毒小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用

鎘（cd）是一種含毒性重金屬，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期為10-30年。這是已知的最接近身體的有毒物質(zhì)。鎘在工業(yè)上用途廣泛,隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展,可通過廢水、廢氣、廢渣排放到環(huán)境中,經(jīng)被污染的食物、飲用水等多種途徑進(jìn)入人體,對多系統(tǒng)器官造成損害。鎘引起的人群慢性鎘中毒已經(jīng)成為一個(gè)受到廣泛關(guān)注的環(huán)境健康問題。有研究報(bào)道,鎘可通過受污染的土壤侵入至稻米中,抽樣調(diào)查結(jié)果顯示,中國多地市場上約10%大米鎘含量超標(biāo)。由于我國65%的人口以稻米為主食,因此,在未來的中國農(nóng)產(chǎn)品安全問題中,重金屬污染將取代農(nóng)藥,成為主要的公共衛(wèi)生問題。貴州是鉛、鋅礦蘊(yùn)藏量較為豐富的地區(qū),同時(shí)分布著大量的鎘,地質(zhì)分布上列為鎘分布區(qū)(CP區(qū),包括黔西南和黔西大部分地區(qū))。1985年,柯長茂報(bào)道貴州省赫章縣天然存在一鎘中毒病區(qū),其鎘負(fù)荷背景與20世紀(jì)70年代日本報(bào)道的神通川流域“痛痛病”病區(qū)的水平相似。近期的流行病學(xué)調(diào)查顯示,該地區(qū)20年來鎘污染一直存在,且鎘的累積水平較高,食物中鎘含量高出對照區(qū)15倍,尿鎘高出對照區(qū)8倍。表明赫章縣仍是鎘污染的重災(zāi)區(qū),當(dāng)?shù)鼐用竦纳眢w健康受到鎘污染的嚴(yán)重威脅。近年來的研究發(fā)現(xiàn),鎘對神經(jīng)系統(tǒng)也有明顯的毒性作用,不少學(xué)者認(rèn)為,鎘可能通過自由基促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用,使細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)受到損害。筆者的前期研究也表明,慢性鎘中毒可致小鼠中腦黑質(zhì)受損,并提示鎘可能是誘發(fā)帕金森病的病因之一。維生素E(VE)和維生素C(VC)是一種有效的抗氧化劑,國內(nèi)外許多資料已證明VE和VC可保護(hù)神經(jīng)組織免受鎘引起的自由基增多和氧化反應(yīng)異常所造成的損害;但是有關(guān)形態(tài)學(xué)方面的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)研究了VE和VC聯(lián)合染毒對慢性鎘中毒小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用及其形態(tài)學(xué)改變,為臨床防治慢性鎘中毒提供實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)依據(jù),對于正確認(rèn)識(shí)和解決鎘污染及其引起的地方病及食物安全問題具有重要的社會(huì)意義。1材料和方法1.1藥物、試劑、培養(yǎng)基氯化鎘(CdCl2,分析純,北京57601化工廠,批號(hào):10873005),維生素E膠囊(純度>99%,廣州白云山制藥總廠,批號(hào):H44021557),維生素C注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號(hào):H44022383),酪氨酸羥化酶抗體(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):BA1454)。氯化鎘染毒溶液的配制:準(zhǔn)確稱取適量的氯化鎘溶解于雙蒸水中,配制成相應(yīng)濃度的氯化鎘溶液。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組選擇健康3月齡清潔級(jí)雄性昆明小鼠125只,體重為25~35g,由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXX[(黔)2002-0001]。實(shí)驗(yàn)室溫度為(18±2)℃,相對濕度為48%~60%。實(shí)驗(yàn)期間,給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及蒸餾水喂養(yǎng),小鼠可自由攝食、飲水。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為5組,分別為正常對照(生理鹽水)組、鎘中毒(以2mg/kg氯化鎘溶液經(jīng)皮下注射染毒,染毒容量為5ml/kg,每周2次)組、鎘中毒+VE(以10mg/kgVE溶液經(jīng)口灌胃染毒,染毒容量為10ml/kg,每天1次)組、鎘中毒+VC(以25mg/kgVC溶液經(jīng)口灌胃染毒,染毒容量為15ml/kg,每天1次)組、鎘中毒+VE+VC組,每組25只。連續(xù)染毒3個(gè)月。每周稱重小鼠體重,觀察一般情況。1.3觀察方法th取整個(gè)中腦,用Bouin液進(jìn)一步固定,石蠟包埋、切片,分別進(jìn)行HE染色、尼氏法染色和酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化ABC法染色,在光鏡下進(jìn)行觀察。其中,TH免疫組化染色的切片采用Biomias99圖像分析系統(tǒng)(四川大學(xué)圖像圖形研究所),在10×40倍的視野下測量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元的二維形態(tài)參數(shù)(面積、周長、最大直徑、等效圓直徑、平均光密度);進(jìn)一步運(yùn)用體視學(xué)的方法計(jì)算出三維形態(tài)參數(shù)(體密度、數(shù)密度、平均截面積、平均體積、圓球度)。每組隨機(jī)取3只小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)域1mm3大小組織塊,按常規(guī)方法制作切片,在電鏡下進(jìn)行觀察。1.4方差分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以u(píng)e0af±s進(jìn)行表示。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(OneWayANOVA)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時(shí),若方差齊時(shí),采用SNK檢驗(yàn)(Student-Newman-Keuls法);若方差不齊時(shí),采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大學(xué)生努力及體重檢測正常對照組小鼠活動(dòng)度大,飲食正常。鎘中毒組小鼠染毒2周后出現(xiàn)活動(dòng)減少,行動(dòng)遲緩,無精打采,飲食量下降等情況;少數(shù)小鼠步態(tài)不穩(wěn),且有兩只小鼠出現(xiàn)向一側(cè)定向旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。鎘中毒+VE組小鼠活動(dòng)未見明顯減少,飲食正常。鎘中毒+VC組小鼠活動(dòng)未見明顯減少,飲食量稍有下降。鎘中毒+VE+VC組小鼠活動(dòng)亦未見明顯減少,飲食量稍有下降。VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠體重的變化見表1。從表1看出,染毒后第1、2、3個(gè)月,與鎘中毒組比較,正常對照組、鎘中毒+VE組、鎘中毒+VC組、鎘中毒+VE+VC組小鼠體重均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而正常對照組、鎘中毒+VE組、鎘中毒+VC組、鎘中毒+VE+VC組小鼠體重間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2鎘兩種方法對黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)HE染色后的病理改變見封三圖1。封三圖1可見,正常對照組黑質(zhì)區(qū)域細(xì)胞密集成群,神經(jīng)元胞體及胞核較大,核仁清晰,胞漿比較豐富(封三圖1A)。鎘中毒組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,胞體變形,少數(shù)細(xì)胞核固縮,胞漿減少,胞漿內(nèi)可見大小不等的嗜酸性顆粒。其中,9只小鼠黑質(zhì)區(qū)域可見較大的軟化灶;大部分小鼠黑質(zhì)區(qū)域內(nèi)尚見廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤,9只小鼠部分淋巴細(xì)胞圍繞在血管周圍形成血管套(封三圖1B、C)。與正常對照組相比,鎘中毒+VE組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元未見明顯減少,但有少數(shù)神經(jīng)元變性。其中,2只小鼠黑質(zhì)區(qū)有散在軟化灶形成,但病灶較小;黑質(zhì)區(qū)可見彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤,偶見淋巴細(xì)胞圍繞在小血管周圍但并未形成血管套(封三圖1D、E)。鎘中毒+VC組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元有少量減少,部分神經(jīng)元變性,細(xì)胞呈圓形或卵圓形,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及核溶解,胞漿內(nèi)未見嗜酸性顆粒出現(xiàn)。其中,5只小鼠黑質(zhì)區(qū)有散在軟化灶形成,軟化灶較鎘中毒+VE組為更廣泛,面積更大,灶內(nèi)大多數(shù)神經(jīng)元消失,殘留神經(jīng)元胞體變小,胞核固縮;2只小鼠黑質(zhì)區(qū)可見彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤,形成血管套(封三圖1F、G)。鎘中毒+VE+VC組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)基本正常,部分神經(jīng)元變性,細(xì)胞呈圓形或卵圓形,少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮及核溶解,胞漿內(nèi)未見嗜酸性顆粒出現(xiàn)。其中,3只小鼠黑質(zhì)區(qū)有散在軟化灶形成,灶內(nèi)大多數(shù)神經(jīng)元消失,殘留神經(jīng)元胞體變小,胞核固縮;2只小鼠黑質(zhì)區(qū)可見彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤,形成血管套。2.3胞漿內(nèi)尼氏體檢測VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)尼氏染色后的病理改變見封三圖2。封三圖2可見,正常對照組黑質(zhì)區(qū)域有成群分布的大多角形或錐體形細(xì)胞,胞漿內(nèi)尼氏體豐富(封三圖2A);鎘中毒組黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元明顯減少,胞漿內(nèi)尼氏體減少或消失,著色淺(封三圖2B);鎘中毒+VE組細(xì)胞形態(tài)大多正常,胞漿內(nèi)尼氏體未見明顯減少(封三圖2C);鎘中毒+VC組細(xì)胞形態(tài)大多正常,胞漿內(nèi)尼氏體有所減少(封三圖2D);鎘中毒+VE+VC組細(xì)胞形態(tài)大多正常,胞漿內(nèi)尼氏體有少量減少(封三圖2E)。2.4鎘立克氏原螯蝦體內(nèi)th陽性反應(yīng)顆粒VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色后的病理改變見封三圖3。封三圖3可見,正常對照組黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量的TH陽性細(xì)胞,胞漿內(nèi)有豐富的棕黃色TH陽性反應(yīng)顆粒(封三圖3A);鎘中毒組黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞明顯減少,胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒較少(封三圖3B);鎘中毒+VE組黑質(zhì)區(qū)有大量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元,胞漿內(nèi)有豐富的TH陽性反應(yīng)顆粒(封三圖3C);鎘中毒+VC組黑質(zhì)區(qū)有大量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元,胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒有所減少(封三圖3D);鎘中毒+VE+VC組黑質(zhì)區(qū)有大量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元,胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒較正常組稍有減少(封三圖3E)。2.5核周質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器的變化VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)病理改變的電鏡觀察結(jié)果見圖4~8。正常組神經(jīng)元胞體較大,核周質(zhì)內(nèi)有較發(fā)達(dá)細(xì)胞器(圖4)。鎘中毒組神經(jīng)元胞體縮小,胞核濃縮變形,核染色質(zhì)邊聚,核膜斷裂;核周隙可見擴(kuò)張,核周質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少或消失(圖5)。鎘中毒+VE組神經(jīng)元胞體較大,核呈圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)松散,均勻分布,未見染色質(zhì)邊聚,核膜清晰完整;核周質(zhì)內(nèi)可見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體及線粒體等細(xì)胞器(圖6)。鎘中毒+VC組神經(jīng)元胞體縮小,核膜邊界清晰,核染色質(zhì)輕度邊聚,核周細(xì)胞器減少,線粒體輕度腫脹,偶見空泡化(圖7)。鎘中毒+VE+VC組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常,核膜邊界清晰有輕度皺褶,未見核染色質(zhì)邊聚,核周質(zhì)內(nèi)可見大量線粒體等細(xì)胞器(圖8)。2.6各組小鼠腦電th臨床療效比較VE和VC染毒慢性鎘中毒小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞核形態(tài)學(xué)參數(shù)的變化見表2。由表2可見,與正常對照組比較,鎘中毒組小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞核體密度、數(shù)密度、平均截面積、平均體積均較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);鎘中毒+VE、鎘中毒+VC、鎘中毒+VE+VC組體密度以及鎘中毒+VC組平均截面積均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鎘中毒組比較,鎘中毒+VE、鎘中毒+VC及鎘中毒+VE+VC組小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞核體密度、數(shù)密度、平均截面積、平均體積均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠腦組織黑質(zhì)區(qū)TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元細(xì)胞核圓球度間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3維生素b.鎘解決方案檢測鎘的中毒機(jī)制比較復(fù)雜,鎘所誘導(dǎo)的氧化損傷已成為鎘毒性機(jī)制的主要方面。慢性鎘中毒可致動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)損傷,而抗氧化劑(如VE、VC等)可抑制鎘的毒性作用。筆者的前期研究也已證明,慢性鎘中毒可致小鼠中腦黑質(zhì)受損。本研究旨在進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)角度探討并比較VE和VC單獨(dú)或聯(lián)合染毒對慢性鎘中毒小鼠中腦黑質(zhì)的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VE和VC單獨(dú)或聯(lián)合染毒的慢性鎘中毒小鼠不僅精神行為表現(xiàn)正常,而且黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的變性、退化及壞死程度均明顯改善;與鎘中毒組比較,黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核體密度、數(shù)密度、平均截面積、平均體積等形態(tài)學(xué)參數(shù)也明顯升高。這些變化說明,經(jīng)VE、VC及VE+VC處理后的慢性鎘中毒小鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷程度明顯改善,結(jié)構(gòu)和功能接近正常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,維生素干預(yù)對鎘中毒的干預(yù)效果依次為VE>VE+VC>VC,其主要表現(xiàn)在:(1)軟化灶:鎘中毒+VE組2只小鼠黑質(zhì)區(qū)有散在軟化灶形成,病灶較小;鎘中毒+VE+VC組3只小鼠有散在軟化灶形成,灶內(nèi)大多數(shù)神經(jīng)元消失,殘留神經(jīng)元胞體變小,胞核固縮;鎘中毒+VC組3只小鼠有軟化灶形成,軟化灶較鎘中毒+VE組和鎘中毒+VE+VC組更為廣泛,面積更大。(2)血管套:鎘中毒+VE組黑質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞圍繞在小血管周圍,但并未形成血管套;鎘中毒+VE+VC組有彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤小血管周圍,形成血管套的有2只小鼠;鎘中毒+VC組血管套的面積更大,淋巴細(xì)胞浸潤更廣泛,形成血管套的有2只。(3)尼氏染色:鎘中毒+VE組胞漿內(nèi)尼氏體未見明顯減少;鎘中毒+VE+VC組細(xì)胞形態(tài)大多正常,胞漿內(nèi)尼氏體僅有少量減少;鎘中毒+VC組胞漿內(nèi)尼氏體有所減少。(4)TH免疫組化染色:鎘中毒+VE組黑質(zhì)區(qū)有大量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元,胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒豐富;鎘中毒+VE+VC組TH免疫組化染色黑質(zhì)區(qū)有大量TH陽性反應(yīng)神經(jīng)元,胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒較正常組稍有減少;而鎘中毒+VC組胞漿內(nèi)TH陽性反應(yīng)顆粒有所減少。(5)電鏡觀察:鎘中毒+VE組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則,核膜較光滑,核仁清晰,未見染色質(zhì)邊聚,胞漿中細(xì)胞器豐富;鎘中毒+VE+