綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù) 編制說明

1《綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)》編制說明綿羊痘和山羊痘（以下簡(jiǎn)稱為羊痘）分別由綿羊痘病毒（Sheeppoxvirus，SPV）和山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GPV）引起。綿羊痘病毒（Sheeppox（Poxviridae）、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirdae）、山羊痘病毒屬病毒（Capripoxvirus,CaPV）。我國(guó)《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》將其列為膜、器官表面廣泛性丘疹或結(jié)節(jié)，皮膚水腫，淋巴結(jié)腫大，消瘦，產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的危害，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病率50%～80%，病死率20%～80%，其中羔羊致死率可達(dá)100%。世界各國(guó)均有羊痘發(fā)病和流行的相關(guān)報(bào)道，目前非洲北部、中東和亞洲的部分國(guó)家流行較為嚴(yán)重。羊痘是阻礙引進(jìn)綿羊和山羊珍貴品種以及養(yǎng)羊業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的主要障礙。嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)。該病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)破壞巨大，可以通過節(jié)肢動(dòng)物機(jī)械性接觸傳播。蚊子、蒼蠅和蜱等均可能是疫情跨地域遠(yuǎn)距離擴(kuò)國(guó)現(xiàn)有疫情提供技術(shù)參考。國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的只有行標(biāo)NY/T576-2015綿羊痘和山羊長(zhǎng)，敏感性不高，結(jié)果判定人為主觀性因素太大。并且該標(biāo)準(zhǔn)缺少病毒實(shí)時(shí)熒2光PCR檢測(cè)方法、病毒LAMP檢測(cè)方分子生物學(xué)檢測(cè)方法相較于病毒分離、中和試驗(yàn)等其它檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快，檢測(cè)結(jié)果量化、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，該方法在在臨床檢測(cè)和大面積監(jiān)測(cè)等方面具有重要價(jià)值，對(duì)當(dāng)前疫情的處理及防控意義重大。血清學(xué)酶聯(lián)免疫抗體檢測(cè)方法具有試驗(yàn)材料易獲取，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、設(shè)備及人員的要求較低、檢測(cè)速度快，敏感性高于中和試驗(yàn)，結(jié)果判定更為簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢測(cè)和疫苗免疫大面積抗體監(jiān)測(cè)等方面具有重要價(jià)值，對(duì)疫情的處理及防控意義重大。目前沒有該病診斷技術(shù)方面的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，尤其在進(jìn)出境動(dòng)物及產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫中，迫切本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了羊痘診斷技術(shù)的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)、原理、試劑與耗材、儀器與設(shè)備、操作步驟、結(jié)果分析與表述。本標(biāo)準(zhǔn)適本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)用、準(zhǔn)確、敏感，具有十分重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。將其在基層推2023年1月，全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目形式，下達(dá)了制定《綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的任務(wù)，任務(wù)編號(hào)：本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管局組織，歸口單位為全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)，起草單位為中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、黑龍江省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、北京億森寶生物科技有限公司，重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、成都海關(guān)技術(shù)中心、山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、河北3金山、闞威、鄭思思、趙儉波、鐘映梅、張旭、曹麗萍、孫航、劉穎昳、李曉霞、徐琦、畢一鳴、王新杰、孫曉明、高姍姍、白雪冬、陳昭旭、曾政、駱璐、蘭鄒然、張?jiān)隆②w浩軍、李棟梁、趙光明、施開創(chuàng)、莫?jiǎng)偬m、林華、雷宇孫雨：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，主持標(biāo)準(zhǔn)修訂、編制及實(shí)驗(yàn)室研究的楊林：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)文本的科學(xué)性與規(guī)范性審蔡金山：青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)臨床陽(yáng)性樣品的收集與鑒鄭思思：青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)臨床陽(yáng)性樣品的收集與鑒4孫航：中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)ELISA方法、PCR方法以及張?jiān)拢荷綎|省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，負(fù)責(zé)臨床陽(yáng)性樣品的收集與鑒李棟梁：北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)臨床陽(yáng)性樣品的收集與鑒莫?jiǎng)偬m：廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，負(fù)責(zé)血清學(xué)試驗(yàn)的開5要按標(biāo)準(zhǔn)各階段為單位分別編寫。列出各階段的關(guān)鍵內(nèi)容。征求意見、審查階段的主要內(nèi)容要詳細(xì)給出。征求意見要對(duì)征求對(duì)象的代表性、回復(fù)情況、討論標(biāo)準(zhǔn)制定思路，制定標(biāo)準(zhǔn)制定方案，明確項(xiàng)目任務(wù)分工，全面計(jì)劃標(biāo)準(zhǔn)制一是查閱文獻(xiàn)資料：查閱了目前國(guó)內(nèi)關(guān)于羊痘的相關(guān)法律規(guī)范要求、研究文獻(xiàn)，部分發(fā)達(dá)國(guó)家做法、WOAH《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》和《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》的要求等。參考我國(guó)NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)技術(shù)規(guī)范。結(jié)合我國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室以及檢驗(yàn)檢疫部門檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作實(shí)際，確定了本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的框架。標(biāo)準(zhǔn)起草工作組認(rèn)6三是進(jìn)行技術(shù)驗(yàn)證：標(biāo)準(zhǔn)起草工作組經(jīng)過技術(shù)咨詢、調(diào)研，收集、整理和分析有關(guān)資料，并結(jié)合羊痘診斷方法、技術(shù)路線、應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)等。并些試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性與可靠性,并在此基礎(chǔ)上，形成“標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿”，然后行病學(xué)中心、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、江西省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心、甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所、西南大學(xué)、西藏自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、北京熱景生物技術(shù)股份二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)大量收集國(guó)內(nèi)外資料的基礎(chǔ)上，篩選建立檢測(cè)技術(shù)，并通過對(duì)大量臨床樣品的檢測(cè)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)所列方法進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)征求國(guó)內(nèi)調(diào)所有檢測(cè)方法一定是最先進(jìn)的技術(shù)和最先進(jìn)的方法，以符合行業(yè)實(shí)情和要求為目標(biāo)，并通過在動(dòng)物疫控系統(tǒng)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的可操作性；三7診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》和我國(guó)NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)規(guī)范的相關(guān)技術(shù)內(nèi)容，在國(guó)際推薦技術(shù)在我國(guó)適用的前提下，優(yōu)先選擇國(guó)際推薦技術(shù)主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則由于目前國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的只有行標(biāo)NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)，但是NY/T576-2015標(biāo)準(zhǔn)中只包含綿羊痘與山羊痘的病毒分離、電鏡檢查、包涵體判定人為主觀性因素太大。并且該標(biāo)準(zhǔn)缺少分子生物學(xué)病毒PCR檢測(cè)方法、病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法、病毒LAMP檢測(cè)方法和血清學(xué)酶聯(lián)免疫抗體檢測(cè)方法的內(nèi)容。中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心參考WOAH發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》和NY/T576-2015綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)，結(jié)合近年來從事羊痘監(jiān)測(cè)工作本標(biāo)準(zhǔn)的臨床診斷和病毒分離鑒定兩部分技術(shù)內(nèi)容主要依據(jù)《默克獸醫(yī)手冊(cè)》和WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）3.8.12章綿羊痘和山羊痘章節(jié)中，病原鑒定從活體或剖檢組織中分離病毒等內(nèi)容，同時(shí)參考我國(guó)近些年發(fā)表的羊課題組從WOAH英國(guó)綿羊痘和山羊痘參考實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買了羊痘病毒的對(duì)照血清、細(xì)胞及疫苗毒株，用于病毒中和試驗(yàn)。同時(shí)利用大量的田間樣品進(jìn)行了所建立標(biāo)準(zhǔn)所列的分子生物學(xué)檢測(cè)方法過程中，課題組分析比F103基因的遺傳精確性較高，可以被用做病毒核酸檢測(cè)的目標(biāo)基因。最終本標(biāo)8測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法檢測(cè)方法。選用O三、主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期本單位組織實(shí)施了相關(guān)重要的試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)施的試驗(yàn)項(xiàng)目主要（一）主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析目前，羊痘病毒的檢測(cè)方法包括病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)方果直觀等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合樣品病毒含量低情況下的快速檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)方法主要是中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法，用于檢測(cè)抗體，從而了解病毒等的優(yōu)化，增強(qiáng)了該方法特異性、敏感性和檢出率。根據(jù)這一思路，應(yīng)用生物毒屬的P32基因作為靶序列，設(shè)計(jì)常規(guī)PCR檢測(cè)方法引物、熒光染料引物與LAMP引物，擴(kuò)增目的基因序列，通過多種試驗(yàn)方案，優(yōu)化了山羊痘病毒屬中不同病料中病毒DNA的提取方法、引物濃度和反應(yīng)最適溫度。根據(jù)優(yōu)化的條件，檢測(cè)不同山羊痘病毒屬的樣品，提高了檢測(cè)的特異性和敏感性。特異性方種方法與其它臨床癥狀類似的口蹄疫等病原均無交叉，均未檢測(cè)到目的條帶或9種方法均具有良好的重復(fù)性。實(shí)時(shí)熒光PC方法特異性強(qiáng)、敏感性高、試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。為了進(jìn)行免疫效果評(píng)估與感染狀況的監(jiān)測(cè)，根據(jù)山羊痘病毒屬的P32基因，表達(dá)了山羊痘病毒屬病毒重組蛋以不同的引物濃度濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選到最佳引物濃度。同時(shí)以不同退（PPRV）、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增以驗(yàn)證本方法的特異性。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，對(duì)照組用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒株以不同的引物濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選到最佳引物濃度。同時(shí)以不同退火溫度進(jìn)行PCR檢測(cè)方法反應(yīng)最終確立最適反應(yīng)條件。篩選最優(yōu)反應(yīng)體系詳見下用分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的OD260值，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)。然后作制備標(biāo)準(zhǔn)品，以各個(gè)濃度的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度在（PPRV）、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增以驗(yàn)證本方法的特異性。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖7)，對(duì)照組為0.77%、1.23%和1.31%，批間重復(fù)變異系數(shù)分別為1.25%、0.91%和變TheCTvaluesof3異TheCTvaluesof3標(biāo)系標(biāo)準(zhǔn)差%行試驗(yàn)，CaPV熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的的檢測(cè)下限為101用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒以不同的引物濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選到最佳引物濃度。同時(shí)以不同反應(yīng)溫（PPRV）、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒（CAEV）以及山羊支原體（Mccp）核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增以驗(yàn)證本方法的特異性。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明(圖10)，對(duì)照組編編用收集保藏的23株羊痘臨床分離滅活毒株抗體ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)上述30份陰性血清，并重復(fù)清號(hào)價(jià)1 編編清號(hào)價(jià)2 3—4 5—6 7—8 9— — — — — — — —編編清號(hào)價(jià) — — — NC//////////采用特異性質(zhì)控血清5份，均為羊痘病毒抗體陰性血清，分別是羊口蹄疫A型病毒陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性血清、山羊關(guān)節(jié)炎/腦炎病毒陽(yáng)性血由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心制備、提供。將這5份血清用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)方法重復(fù)三次檢測(cè)，同時(shí)采用中和試驗(yàn)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，比較2種檢測(cè)方法的特驗(yàn)值值9—8 6—8——0清NC//////////2.2.敏感性指標(biāo)驗(yàn)證2.2.1最小檢出量試驗(yàn)1:512、1:1024、1:2048進(jìn)行稀釋，采用酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)法對(duì)上述稀釋后的血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用中和試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，三次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，測(cè)山羊痘病毒屬病毒抗體的靈敏度要高于中和試驗(yàn)，更適用于抗體含量較低的///NC///30號(hào)為綿羊陽(yáng)性血清。由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心制備、保存。采用酶聯(lián)免率。結(jié)果顯示：三次酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)法和份山羊陽(yáng)性血清、15份綿羊陽(yáng)性血清），酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)法和中和試驗(yàn)的檢1+2+3+4+5+6+7+8+94++++++++++++++++++++++/////NC/////2、中和試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：中和效價(jià)≥1：5判為陽(yáng)性，中和效價(jià)＜1：5判為陰性。目前，羊痘病毒的檢測(cè)方法包括病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)方果直觀等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合樣品病毒含量低情況下的快速檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)方法主要是中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)方法，用于檢測(cè)抗體，從而了解病毒測(cè)方法、血清中和試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體等進(jìn)行羊痘病毒診斷。我國(guó)在2015年頒布了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《綿羊痘和山羊痘診斷技術(shù)》（NY/T576—2015），推薦使用的診斷方法包括電鏡觀察、病毒分離、血清中和試驗(yàn)診斷方法。這些方法對(duì)羊痘診斷起到了重要的作用，隨著近年來分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合我國(guó)羊痘診斷技術(shù)究的新進(jìn)展、新成果薦標(biāo)準(zhǔn)等，將相關(guān)診斷技術(shù)進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化，使該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完整、系統(tǒng)、實(shí)羊痘在我國(guó)已經(jīng)有發(fā)病的報(bào)道，并且有文獻(xiàn)介紹了相關(guān)病原檢測(cè)方法。分子生物學(xué)檢測(cè)方法可以使檢測(cè)速度更快，檢測(cè)結(jié)果量化從而更加準(zhǔn)確，可快速確定病原。血清學(xué)抗體檢測(cè)方法可以快速檢測(cè)疫苗免疫后動(dòng)物體內(nèi)的抗體水四、采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度，以及與國(guó)際、國(guó)內(nèi)同類標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比情況，或與測(cè)試的國(guó)外樣品隨著羊痘在世界范圍的不斷蔓延，建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。目前，國(guó)際上針對(duì)綿羊痘和山羊痘（羊痘）僅有WOAH陸生動(dòng)物手冊(cè)2.7.14，W