毛兩面針藥材指紋圖譜評價體系的建立

毛兩面針藥材指紋圖譜評價體系的建立

摩擦面針的兩個孔是太陽針d.f.快樂sum和exqui套的植物根和莖的兩個孔是太陽針的一個孔和一個孔，由兩個孔組成。毛兩面針含有橙皮苷(hesperidin)、毛兩面針素(toddalolatone)、乙氧基白屈菜紅堿(ethoxychelerythrine)、氯化兩面針堿(nitidinechloride)、木蘭花堿(magnoflorine)等多種活性成分。據(jù)現(xiàn)代藥理學報道,橙皮苷具有增強毛細血管韌性、維持滲透壓、縮短出血時間、降低膽固醇等藥理活性,是成藥“脈通”的主要原料之一;氯化兩面針堿和乙氧基白屈菜紅堿具有抗炎、抗真菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、強心等較強的活性作用;木蘭花堿具有抗炎、消除運動性疲勞等作用;毛兩面針素暫無相關(guān)文獻報道。毛兩面針因其資源分布廣泛、植物形態(tài)與兩面針無明顯區(qū)別、種植培養(yǎng)難度較小,民間已普遍將其代替兩面針使用,廣西中藥材地方標準也將其收載入冊,現(xiàn)已導致各地藥材市場兩面針品種混亂。為了更好地控制毛兩面針的質(zhì)量,本文對市面上銷售的18批藥材樣品進行指紋圖譜研究,并采用相似度評價,系統(tǒng)聚類分析,建立了相應的HPLC指紋圖譜評價方法,為評價毛兩面針藥材質(zhì)量提供了一定的實驗依據(jù)。1儀器和試劑盒1.1復合濾材檢測Agilent1100高效液相色譜儀(包括G1311A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1315A二極管陣列檢測器,美國安捷倫科技有限公司);AG285分析天平(瑞士Mettler公司);KS600D型超聲波清洗儀(寧波科生儀器廠);臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠);MS1型漩渦震蕩混合器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)。1.2藥物種及藥物毛兩面針藥材批號及來源見表1,經(jīng)中南大學湘雅醫(yī)院藥劑科雷鵬副教授鑒定為蕓香科花椒屬植物毛兩面針Z.nitidumf.fastuosum干燥根和莖。對照品橙皮苷(批號110721-201014)、氯化兩面針堿(批號110848-200502)、乙氧基白屈菜紅堿(批號110847-200601)及毛兩面針素(批號111531-200902)均購自中國食品藥品檢定研究院,木蘭花堿(批號BBP01035)購于云南西力生物技術(shù)有限公司,其純度均達到98%以上;乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1檢測條件及進樣量色譜柱:PromosilC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸加0.2%三乙胺水溶液(B),梯度洗脫(0~10min,12%A;10~18min,12%A→23%A;18~30min,23%A→28%A;30~42min,28%A→45%A;42~70min,45%A→85%A);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:283nm;柱溫:20℃;進樣量:10μL;理論板數(shù)以橙皮苷峰計不得少于5000。2.2對照品儲備液的制備精密稱取乙氧基白屈菜紅堿10.04mg、氯化兩面針堿13.24mg、木蘭花堿19.13mg、橙皮苷21.26mg、毛兩面針素的對照品21.60mg,分別置100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得對照品儲備液;依次精密吸取上述儲備液7、10、2、1、5mL,置25mL量瓶中,搖勻,制成混合對照品溶液(濃度分別為53.56、85.04、10.59、4.02、43.20μg·mL-1)。2.3甲醇提取物的制備稱取毛兩面針藥材粉末(過24目篩,45℃干燥至恒重)約0.5g,精密稱定,分別置具塞刻度管中;第1次提取,精密加入甲醇10mL,密塞,搖勻,超聲(250W,35kHz),提取0.5h后,取出,放冷至室溫,離心(5000r·min-1,5min),轉(zhuǎn)移上清液至25mL量瓶中;第2次提取,精密加入80%甲醇同上操作。合并2次濾液,以甲醇定容至刻度,搖勻,靜置過濾,取續(xù)濾液待用,進樣前用0.45μm微孔濾膜濾過,備用。2.4測量分別精密吸取混合對照品溶液與各批次供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件,測定,并記錄色譜圖。2.5方法研究2.5.1儀器精密度試驗稱取S1號樣品的供試品溶液,連續(xù)進樣6次,以8號峰橙皮苷作為參照峰S,計算出1~23號共有指紋峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3.0%,表明該儀器精密度良好。2.5.2重復性測定結(jié)果分別稱取S1樣品6份,分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行分析測定,以8號峰作為參照峰S,考察共有峰相對保留時間和相對峰面積,結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD小于1.0%,相對峰面積的RSD小于3.0%,表明該方法重復性良好。2.5.3穩(wěn)定性試驗取同一份由S1號樣品制備的供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別在0、3、6、9、12h不同時間點進行測定,以8號峰作為參照峰S,考察共有峰相對保留時間和相對峰面積,結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD小于1.0%,相對峰面積的RSD小于3.0%,表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.6色譜對照試驗按“2.3”項下方法制備18批藥材的供試品溶液,照“2.1”項下條件進行測定分析。通過比較各批次藥材色譜圖,確定了23個特征峰,建立毛兩面針藥材指紋圖譜。將化學信息較多的S1號樣品設(shè)為典型色譜圖,與混合對照品圖譜(見圖1)對照,指認其中5個色譜峰,分別為木蘭花堿(5號)、橙皮苷(8號)、毛兩面針素(9號)、氯化兩面針堿(10號)以及乙氧基白屈菜紅堿(11號),確定8號峰橙皮苷為毛兩面針的主要指標成分,將其作為參照峰(見圖2)。各色譜峰對內(nèi)參照峰的相對保留時間定性,計算各色譜峰對參照峰的相對峰面積,若指紋圖譜中在某相對保留時間處無峰,則相對峰面積記錄為0,仍給予相應峰號,以保證各色譜指紋圖譜的完整性將其中第8號峰橙皮苷作為參照峰(見圖2)。2.7指紋圖譜驗證運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件,對上述18批樣品進行相似度評價,選擇圖譜信息較多的S1號藥材樣品色譜圖作為參照,經(jīng)中位數(shù)法進行多點校正自動匹配計算后生成對照圖譜。S1~S18號毛兩面針樣品相似度評價結(jié)果分別為0.979、0.876、0.934、0.902、0.973、0.933、0.966、0.986、0.958、0.903、0.955、0.980、0.986、0.932、0.931、0.928、0.899、0.886,可以看出18批毛兩面針樣品中大多數(shù)批次指紋圖譜與對照圖譜比較,相似度>0.900,少數(shù)批次相似度較低,表明該藥材可能與儲存條件,采收季節(jié),藥材加工方法以及選擇藥用部位有關(guān),其內(nèi)在質(zhì)量存在一定差異,需做進一步的分析,進行圖譜模式識別分類,以便建立真實可靠的毛兩面針藥材標準指紋圖譜。2.8化學識別2.8.1樣品聚類分析將18批毛兩面針藥材樣品作為研究對象,獲得23個共有色譜峰,將8號峰(橙皮苷)設(shè)為參照峰,規(guī)定其相對峰面積為1,其他各峰面積均按相對峰面積折算,將各色譜峰相對于參照峰的峰面積量化,得到18×23階原始數(shù)據(jù)矩陣,運用統(tǒng)計分析軟件SPSS16.0,采用離差平方和法(Ward’sMethod),利用歐氏距離(Euclidean)作為樣品的測度,對其進行聚類分析,聚類分析結(jié)果見圖3。18批藥材樣品除S13號外大致可分為兩類,一類為S2、S4、S17、S18號樣品,其他批次歸入另一類。分析S13號樣品各成分含量普遍偏低,懷疑藥材中摻雜有其他雜質(zhì)。2.8.2分析樣本坐標主成分分析是從多個數(shù)值變量(指標)之間的相互關(guān)系入手,利用降維的思想,將多個變量(指標)化為少數(shù)幾個互不相關(guān)的綜合變量(指標)的統(tǒng)計方法。各毛兩面針藥材樣品經(jīng)上述實驗獲得各批樣品的色譜數(shù)據(jù),以相對保留時間定位,以對應的峰面積的積分值作為數(shù)據(jù)源,形成23個樣本數(shù)據(jù)矩陣,采用SPSS16.0軟件對矩陣進行分析,以主成分PC1和PC2所組成的維投影圖見圖4。圖中每個點對應每批樣品,根據(jù)各批次投影點與坐標軸距離的不同,可將所有批次分為3個區(qū)間:S13號與其他所有批次距離較遠,被單獨列為一類;另外如圖圓圈內(nèi)所示樣品批次投影點較為集中,列為一類;其他批次投影點更加接近PC1,游離主體分布投影群,被視為一類。該統(tǒng)計結(jié)果與聚類分析基本一致。2.9指紋圖譜的建立根據(jù)相似度評價并結(jié)合系統(tǒng)聚類分析和主成分分析結(jié)果,本實驗剔除了相似度低且不具有代表性的S2、S4、S13、S17、S18號樣品,選取了13批品種、炮制、貯藏條件均相似或基本一致且經(jīng)生藥學鑒定確定的毛兩面針藥材,建立其標準指紋圖譜,13批樣品編號為S1、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S14、S15、S16。將上述13批樣品數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件,13批毛兩面針的指紋圖譜疊加圖見圖5,標準指紋圖譜見圖6。相似度計算結(jié)果表明,13批樣品相似度均>0.900,符合國家藥典委員會的要求,可作為毛兩面針的品質(zhì)評價,為完善兩面針質(zhì)量標準的制定提供實驗依據(jù)。3標準曲線和主成分分析本實驗選用具有高靈敏度、精密度及較好的線性范圍紫外檢測器。經(jīng)比較,選用乙腈-水(含0.2%磷酸和0.2%三乙胺)作為流動相,采用梯度洗脫方式,能較更多地體現(xiàn)各樣品中指紋圖譜的化學信息。色譜柱是HPLC系統(tǒng)的核心部件,不同廠家生產(chǎn)的色譜柱可能存在較大差異,本實驗考察了WeichromC18(4.6mm×250mm,5μm)、DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)、OdyssilC18(4.6mm×250mm,5μm)以及PromosilC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,結(jié)果以PromosilC18的運行結(jié)果較好,其基線較穩(wěn)定,且能更好地豐富色譜信息,能在最短時間以較大程度表現(xiàn)該藥材的化學信息。中藥樣品成分比較復雜,通常采用二極管陣列檢測器進行檢測,這樣有利于最佳檢測波長的選擇,本實驗采用DAD二極管陣列檢測器繪制的三維圖譜,為了在圖譜中不丟失信息,盡可能反映組分全貌,則本實驗選用283nm作為測定波長。采用峰面積較大的橙皮苷峰面積作為基準計算相對峰面積,既能表征各成分在同一樣品中的相對含量,又能較為客觀地反映不同樣品中各共有峰所代表的化學成分含量高低,在本文色譜條件下,能同時記錄毛兩面針中水溶性成分和脂溶性成分的色譜峰,較全面地反映該藥材的化學組成。應用系統(tǒng)聚類分析和主成分分析2種化學計量學方法對毛兩面針色譜積分數(shù)據(jù)進行了模式識別的探討,