瘤胃微生物的研究進展

瘤胃微生物的研究進展

腫瘤胃中含有大量細菌（約200種，1011細胞）、纖毛蟲（25種，104106細胞）、厭氧瘤（5種，103105細胞）和厭氧菌（107109細胞）。目前，對腫瘤和胃微生物的了解仍然有限，主要受以下條件的限制：（1）一些微生物無法培養(yǎng)；（2）外部培養(yǎng)和微生物實際生活環(huán)境的偏差。換言之，培養(yǎng)后，與微生物群落的原始結(jié)構(gòu)發(fā)生了相關(guān)的變化，并形成了不同程度的新群落結(jié)構(gòu)?；诤怂嵝蛄蟹治龅默F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)為人們提供了有效的方法,可以用來鑒定微生物的種類、完善微生物的分類系統(tǒng)。目前已較為成熟的技術(shù)有核酸探針、基因序列分析、遺傳指紋技術(shù)、全細胞原位雜交和實時定量PCR技術(shù)等,本文介紹了這些技術(shù)在瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)方面的研究進展。1自然微生物的培養(yǎng)以及個微生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建核酸探針即設(shè)計成目標基因的互補序列,通過與目標基因雜交可以得到細菌在整個微生態(tài)系統(tǒng)中的信息。利用該技術(shù),首先要明確是要鑒定和計數(shù)微生物,還是要監(jiān)測微生物的活性或功能,這決定了在實際操作中目標核酸的選擇以及核酸探針的設(shè)計。核酸探針一般可以分為兩類:基于DNA和基于RNA方法的探針。1.1基于dna探針的腸道微生物檢測方法Attwood等最早利用核酸分析技術(shù)研究了將細菌引入瘤胃后的存活問題,標記布氏普雷沃氏菌(Prevotellabryantii)的染色體DNA,隨機克隆,以測定該細菌被引入到瘤胃后的存活時間。結(jié)果顯示,B14菌株在體外培養(yǎng)時的半衰期為9h,但接種到瘤胃后,僅為30min。Whitehead和Cotta克隆了一種淀粉酶基因作為DNA探針,可以快速而準確地檢測人類或牛腸道中與人類結(jié)腸癌有關(guān)的牛鏈球菌(Streptococcusbovis)。Mannarelli等利用DNA探針研究了胃腸道中微生物種群的多樣性,如絲狀桿菌(Fibrobacter),反芻獸新月形單胞菌(Selenomonasruminantium)和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)。現(xiàn)在大量的研究均采用質(zhì)?；蛉旧wDNA的隨機克隆片段作為探針。用基于DNA的方法研究胃腸道微生物的分子生態(tài)學(xué)具有很高的特異性和靈敏性,該方法的不足在于需要純培養(yǎng)的菌株,而細菌體外培養(yǎng)與其真實生活環(huán)境中有一定的差異。此外,與RNA技術(shù)相比,該技術(shù)不適合用來細致地研究胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu),但其可以用于功能基因的分析。1.2黃粱夢菌群落特征及微生物多樣性的研究16SrRNA方法的理論和實際操作前人已有大量的報道,研究者完善地建立了利用小亞基(SSU)rRNA-16SrRNA研究胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)的方法。這些方法也適用于23SrRNA,由于其信息量很大(3000bp),故在技術(shù)更為成熟時,能得到更為廣泛的應(yīng)用。16SrRNA保守區(qū)的互補寡核苷酸可用來設(shè)計通用探針,而其可變區(qū)則用來設(shè)計成高特異性的探針,用來鑒定微生物的屬或種,乃至某一菌株。利用16SrRNA寡核苷酸探針研究牛瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和多毛毛螺菌(Lacbnospiramultiparus)的數(shù)量與變化及其在復(fù)雜的微生物區(qū)系中的活性,結(jié)果表明,相關(guān)種的F.succinogenes具有遺傳多樣性,在該試驗中,傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)法沒有獲得成功。群特異性的16SrRNA寡核苷酸探針可以用來研究不同家畜(牛、綿羊、山羊、豬)胃腸道中細菌、真核生物和古細菌的數(shù)量,試驗發(fā)現(xiàn)這三類微生物數(shù)量的變化范圍分別為60%~90%、3%~30%和0.5%~3%,且發(fā)現(xiàn)不同動物消化道中占優(yōu)勢的甲烷菌是不同的。Krause和Russell利用探針研究了莫能霉素添加水平對瘤胃中氨基酸利用菌及其脫氨基作用的影響,探針還被用于白色瘤胃球菌(Ruminlcoccusalbus)和黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)在發(fā)酵纖維二糖、纖維素及堿處理麥秸時細菌間相互關(guān)系的動力學(xué)研究。結(jié)果表明,16SrRNA寡核苷酸探針能有效地鑒定培養(yǎng)物中特定的細菌,而且還能提供細菌間競爭作用的一些信息。這些探針還被用來研究R.albus、R.flavefaciens和F.succinogenes在底物充足或不足的環(huán)境中對纖維二糖和纖維素的競爭現(xiàn)象。黃慶生等△利用探針研究了酵母培養(yǎng)物對瘤胃細菌的影響,發(fā)現(xiàn)添加酵母培養(yǎng)物能顯著提高黃化瘤胃球菌的相對比例。Finlay等利用熒光標記的16SrRNA寡核苷酸探針研究了瘤胃中的古細菌,證實內(nèi)毛亞科(Entodinium)和反芻厚毛蟲(Dasytricharuminantium)的細胞液泡外含有內(nèi)共生的甲烷菌。Sharp等利用SSUrRNA探針研究瘤胃和體外連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物區(qū)系,均發(fā)現(xiàn)原蟲和產(chǎn)甲烷菌之間有很強的互作關(guān)系:甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)是瘤胃古細菌中最大的一類,占89.3%,而且在99.2%的原蟲碎片均有發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)48h后,隨著原蟲數(shù)量的下降,Methanobacteriaceae占古細菌的比例降為54%,但占古細菌的12.1%的甲烷微菌科(Methanomicrobiale)在原蟲碎片中沒有檢測到,這說明Methanomicrobiale是游離在原蟲外的。2利用cola和h-randth外生菌培養(yǎng)和利用菌株的身份混養(yǎng)及克隆隨著方便實用的DNA克隆技術(shù)及PCR技術(shù)的發(fā)展,通過SSUrRNA序列的分析比較,已能對復(fù)雜的微生物系統(tǒng)進行研究。該技術(shù)還沒有廣泛地應(yīng)用到腸道生態(tài)系統(tǒng)的分析,目前有白蟻腸道、人類結(jié)腸的研究報道,也有對瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的研究報道,這些試驗結(jié)果都表明腸道生態(tài)系統(tǒng)具有高度的多樣性。Whitford等從飼喂全混合日糧(26%苜蓿,30%青貯玉米和35%精料)的奶牛瘤胃液中制備了兩個基因克隆庫,通過分析發(fā)現(xiàn)133個序列中有101個與瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)是同源的,但大部分是以前從未培養(yǎng)或分離成功的細菌。Tajima等從飼喂全混合日糧牛的瘤胃液相、固相和飼喂高粗料(苜蓿、貓尾草)的瘤胃液中制備了3種SSUrDNA基因克隆庫,這3個基因克隆庫幾乎包含了所有的SSUrDNA全序列(1.5kp),通過分析(161個克隆),只有10個序列(6.2%)與已知的細菌一致,34.6%的序列與已知細菌具有90%~98%的同源性,其余的與現(xiàn)已知細菌的同源性均小于90%。與體內(nèi)試驗結(jié)果相反,體外培養(yǎng)得到的細菌與現(xiàn)已知的細菌高度一致。Koike等利用該技術(shù)研究了綿羊瘤胃中附著在鴨茅和苜蓿稈上的微生物區(qū)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)91個克隆中有38個克隆與已知的細菌同源性低于90%。這些試驗表明有很多微生物在體外培養(yǎng)不能成活,從而得不到徹底的研究。目前利用該方法研究瘤胃中的原蟲和真菌還不如細菌深入和成熟。Embley等通過分析多泡多甲蟲(Polyplastronmultivesiculatum)和D.ruminantium的18SrRNA序列,對其進行了分類。Dore和Stahl通過對18SrRNA序列的分析和比較,將Neocallimastix屬分類于壺菌綱(Chytridiomycete);研究者還對四種瘤胃真菌進行了18SrRNA序列分析,數(shù)據(jù)與前人研究結(jié)果一致,而且還發(fā)現(xiàn)瘤胃真菌也具有同源性。以上研究發(fā)現(xiàn)了一些新的有用信息,但也有一些問題需要得到解決。這些問題主要體現(xiàn)在核酸的抽提、PCR及克隆過程中所產(chǎn)生的一些偏差和假象。例如,在數(shù)據(jù)庫的建立過程中,由于檢測手段的限制,將一些人工合成的序列錄入了數(shù)據(jù)庫,從而導(dǎo)致樣品的基因克隆庫和凝膠電泳圖譜很難分析甚至得出錯誤的結(jié)果。3腸道生態(tài)系統(tǒng)的檢測基因指紋技術(shù)為研究菌群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化提供了有效的手段。Muyzer等首次將遺傳指紋技術(shù)引入微生物生態(tài)學(xué)研究中,利用rDNAPCR擴增后的片段進行變性梯度凝膠電泳(DGGE),分析研究了環(huán)境中微生物區(qū)系的變化。利用DGGE和溫度梯度凝膠電泳技術(shù)(TGGE)可以將長度相同但序列不同的DNA片段分開,其原理是在線性梯度變性或線性溫度變性的聚丙烯酰胺凝膠上,DNA雙鏈分子會逐步解鏈,遷移率也隨之下降。DNA序列不一樣,其解鏈的溫度和所需的變性濃度也不一樣,最終各種不同的DNA片段會在凝膠上呈現(xiàn)不同的條帶,然后通過EB、SYBRGreenI或銀離子染色即可成像,進而進行分析,通過對電泳圖譜的直接分析可以對微生態(tài)系統(tǒng)中的各種細菌進行相對定量。該技術(shù)已經(jīng)廣泛地用來研究復(fù)雜的環(huán)境微生態(tài)系統(tǒng)、監(jiān)測其區(qū)系組成變化、分離細菌、比較各種DNA抽提方法的效率以及檢測PCR和克隆過程中產(chǎn)生的偏差等。但由于腸道系統(tǒng)中微生物種類繁多,產(chǎn)生的條帶也多,而且很復(fù)雜,會對分析造成很大的困難,這在一定程度上限制了該技術(shù)在腸道生態(tài)系統(tǒng)上的應(yīng)用。Cann等利用該方法純化了瘤胃液中的纖維素利用菌:F.succinogenes,R.albus和R.flavefaciens。DGGE圖譜顯示:R.flavefaciens9個菌株的16SrRNA的V3區(qū)經(jīng)過PCR擴增后,在凝膠上處于同一個位置,這表明R.flavefaciens的16SrRNA的V3區(qū)沒有多樣性,而R.albus則相反,9種菌株的該區(qū)呈現(xiàn)出高度的多樣性。Ruminococcus兩個種的電泳圖譜與F.succinogenes有很大的不同,在電泳圖譜上,可以很容易地將F.succinogenes,R.albus和R.flavefaciens的PCR產(chǎn)物區(qū)分開。這表明,DGGE可以將分類相近的菌株進行分離,故該技術(shù)可以用來分析瘤胃液中纖維素利用菌的多樣性及其動態(tài)變化。Kocherginsdaya等利用該技術(shù)分析了飼喂不同日糧肉牛的瘤胃液微生物區(qū)系。提取總?cè)旧wDNA,擴增16SrDNA的V3或V9區(qū),結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼喂干草日糧的肉牛其圖譜相似,共出現(xiàn)了16條明顯的帶,其中5條占優(yōu)勢,但飼喂精料為主的結(jié)果與前者不同,每頭牛的圖譜都不一樣。Zhu等利用DGGE分析了斷奶仔豬糞樣體外培養(yǎng)甜菜渣時細菌區(qū)系的變化情況,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)后,DGGE圖譜的電泳條帶會出現(xiàn)3條優(yōu)勢條帶,通過16SrDNA的序列分析,這3種菌中兩種與挑剔真桿菌(Eubacteriumeligens)和裂果膠毛螺菌(Lachnospirapectinoschiza)具有92%和96%的同源性,另外一種與L.pcetinoschiza具有95%的同源性。他們還利用該技術(shù)研究了山羊瘤胃細菌的多樣性,發(fā)現(xiàn)在山羊飼料中添加大豆黃酮后,DGGE譜帶會發(fā)生不同程度的變化(30%~46%)。這些試驗結(jié)果表明,DGGE能有效地分析瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的多樣性、監(jiān)測其種群的變化,但微生態(tài)系統(tǒng)中有些微生物含量很少,若其DNA占總DNA量不足1%時,利用該技術(shù)仍然很難檢測到,有待于分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展和完善得以解決。4細菌的原位生長情況全細胞原位雜交主要是指寡核苷酸探針與從樣品中富集到的細胞進行雜交,其中最為常用的方法是用互補的熒光標記的寡核苷酸探針與細胞內(nèi)的rRNA雜交,然后通過熒光顯微鏡就可以觀察到樣品中特定微生物的存在,該技術(shù)最早由Delong等提出。Poulsen等利用該技術(shù)研究了用鏈霉素處理的大鼠大腸中的微生物區(qū)系,得到了腸組織中大腸桿菌(Escherichiacoli)的分布情況。該方法還能快速檢測體外不能培養(yǎng)的一些細菌的情況以及它們與宿主或其他細菌細胞之間的關(guān)系,通過分析單細胞中DNA或RNA可得到細菌的原位生長速度,例如,附著在腸壁上的細菌的傳代時間為30~80min,而腸腔中的細菌則要慢得多。利用16SrRNA寡核苷酸探針全細胞熒光原位雜交可以對單細胞進行定性和計數(shù),Franks等設(shè)計特異性的探針研究了人類糞便中厭氧菌的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)和吉氏擬桿菌(Bateroidesdistasonis)特異性探針檢測到的細菌為5.4×1010細胞/克干物質(zhì),Streptococcus-Lactobacillus和Clostridiumcoccoides-Eubacteriumrectale特異性探針檢測到的細菌分別為1.7×107~7×108和7.2×1010細胞/克干物質(zhì)。這種結(jié)合了現(xiàn)代分子生物學(xué)和圖像分析學(xué)的技術(shù)可以在單細胞水平上分析胃腸道中細菌的結(jié)構(gòu)和功能。5環(huán)次數(shù)與rt-pcr檢測實時熒光定量PCR技術(shù)(real-timePCR,RT-PCR),是指在PCR反應(yīng)體系中引入熒光標記,利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程,對未知模板進行定量分析。與傳統(tǒng)的PCR定量方法相比,該技術(shù)測定的不是PCR終產(chǎn)物,而是由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)(Ct值),由于終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,而Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比,故RT-PCR更能反應(yīng)真實情況和準確定量。Tajima等利用該技術(shù)研究了日糧變化對瘤胃微生物區(qū)系的影響,發(fā)現(xiàn)當荷斯坦奶牛日糧從干草型轉(zhuǎn)為谷物型時,纖維素利用菌F.succinogenes和R.flavefaciens的數(shù)量均會大幅下降。本試驗室研究發(fā)現(xiàn),當?shù)静堇w維與玉米淀粉發(fā)生正組合效應(yīng)時,F.succinogenes,R.flavefaciens和真菌均會上升,這表明與纖維素消化有關(guān)的微生物數(shù)量的增加有可能是纖維類飼料與淀粉類飼料發(fā)生正組合效應(yīng)的機制之一(未發(fā)表資料)。此外,我們還研究了體外培養(yǎng)苜蓿時添加二溴乙烷磺酸鈉(BES)對瘤胃微生物的影響,發(fā)現(xiàn)BES添加對瘤胃產(chǎn)甲烷菌和真菌有抑制作用,但會提高F.succinogenes的數(shù)量,該結(jié)果表明BES在減少瘤胃甲烷產(chǎn)量的同時,有可能影響