重樓愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

重樓愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究

巴黎植物屬于白合科，是一種多年生草本植物。作為該屬植物的分布中心之一，有17種和10種變體。本種植物不僅具有清熱解毒、消腫脹、止痛、凈化肝臟、鎮(zhèn)靜等功效，還具有止血、腫瘤、抗高血壓、抗凝劑和心血管等生理活性。因此，對這一自然資源的全面開發(fā)和利用具有重要意義。然而，隨著近年來重建筑物資源的需求逐年增加，且主要領(lǐng)域的開采和挖掘忽視了重建筑物的保護(hù)和繁殖，野生物種資源嚴(yán)重受損，供需矛盾突出。因此，對重建筑物的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了研究，解決了資源保護(hù)和開發(fā)之間的矛盾。用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分的工業(yè)化研究始于20世紀(jì)50年代,已有許多成功的先例.但尚未見到重樓細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)報導(dǎo).1材料和方法1.1植株培養(yǎng)和管理重樓取自四川峨眉山海拔2450m的山上,整株植株帶土挖取,置于自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室.接種前置于18℃弱光下保存,一般滯留2～4d即接種培養(yǎng).取材分萌芽期、展葉期、花冠露白期和倒苗期.1.2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)采用MS(Murashige和Skoog)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度和種類的生長調(diào)節(jié)物質(zhì).根據(jù)使用的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度,共設(shè)置15個處理用于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng),見表1.1.3芽、葉的活化植株清洗干凈后,除幼嫩葉片外,其余材料均在流水中沖洗2h以上.然后對材料分別進(jìn)行消毒滅菌,先用70%的酒精浸泡30s,然后分別用/的升汞滅菌數(shù)分鐘.一般幼嫩的芽和葉片滅菌3～4min;根莖滅菌10min,子房和根滅菌6～8min.滅菌以后的材料用無菌水清洗3～5次,最后分別接種于不同處理的培養(yǎng)基上,置于20℃溫度條件下培養(yǎng).2結(jié)果與分析2.1附加naa和b、h的組合對愈傷組織的誘導(dǎo)效果試驗(yàn)設(shè)置的15個處理所誘導(dǎo)形成的愈傷組織數(shù)和小球莖數(shù)的結(jié)果見表2.結(jié)果顯示,15個處理中,以M(MS+BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+IAA1.0mg/L)誘導(dǎo)愈傷的效果最好,誘導(dǎo)頻率最高,達(dá)28.89%(圖1).其次為B(MS+BA1.0mg/L+IAA2.0mg/L)和H(MS+BA2.0mg/L+IAA1.0mg/L),誘導(dǎo)頻率分別為26.7%和21.95%.同時,在B和H的處理中,從幼芽基部還能誘導(dǎo)出幾個小球莖(圖2).從分析附加的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可看出,加NAA的處理中,愈傷組織形成均少,且沒有球莖的形成.雖然M組合誘導(dǎo)愈傷的頻率最高,但B和H的組合不但可以誘導(dǎo)愈傷而且可以誘導(dǎo)球莖的形成,這個結(jié)果與同科不同屬植物延齡草的組織培養(yǎng)研究中所得的結(jié)論是一致的,且其使用濃度以1.0mg/LBA和2.0mg/LIAA為最佳組合.2.2種外植體誘導(dǎo)頻率試驗(yàn)采用根、根莖、子房、幼芽和葉片5種器官為外植體,分別接種于15種處理的培養(yǎng)基上,試驗(yàn)結(jié)果見表3.由表3可看出,根和葉片既不能誘導(dǎo)出愈傷,也不能誘導(dǎo)出小球莖,接種后很少啟動,污染也較少,大約2個月后干枯死亡.而根莖、子房、幼芽都能不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織,特別是幼芽,不但誘導(dǎo)出的愈傷組織塊數(shù)最多誘導(dǎo)頻率最高達(dá)且還能誘導(dǎo)出小球莖.可見,不同的外植體的誘導(dǎo)頻率差異很大.2.3不同發(fā)育階段的常用植物中愈傷組織的誘導(dǎo)頻率試驗(yàn)中作為外植體的根和根莖取自4個時期,即萌芽期、展葉期、花冠露白期和倒苗期.子房取自花冠露白期,葉片取自萌芽和展葉期,幼芽取自萌芽期、展葉期、倒苗期.不同發(fā)育階段的根莖對誘導(dǎo)頻率具有顯著的影響,結(jié)果列于表4.從表4的結(jié)果可看出,以展葉時旺盛生長的根莖作外植體,其愈傷組織的誘導(dǎo)頻率最高,達(dá)16.6%.萌芽期取材次之.在花冠露白期和倒苗期,根莖則很難誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織.在四川峨眉山海拔2000m左右的環(huán)境下,重樓屬植物的生長期一般為4月至5月中下旬,大約二個月左右的時間.因此,取材時間應(yīng)在4月至5月上旬這段時間.但在這段時間取材培養(yǎng),會發(fā)現(xiàn)外植體極易污染.必須采取一些措施減輕或控制外植體的污染.2.4愈傷組織的增殖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),不同來源愈傷組織的保持能力差異較大.在M培養(yǎng)基上形成的愈傷組織增殖較快,但極易褐變,壽命較短.B、H培養(yǎng)基上形成的愈傷組織增殖較慢,但愈傷組織的質(zhì)地較堅(jiān)硬,呈淡黃色,展示較好的保持潛力.從外植體來看,幼芽基部形成的愈傷組織增殖較快,愈傷組織呈顆粒狀,較易分散.根莖形成的愈傷組織質(zhì)地較疏松,時間長了以后,愈傷組織易纖維化,失去增殖能力.子房形成的愈傷組織也較疏松,且易褐變3重樓協(xié)同培養(yǎng)的可行性以上試驗(yàn)基本上找到了誘導(dǎo)重樓產(chǎn)生愈傷組織的最佳外植體取材時間及培養(yǎng)條件,即4月至5月上旬獲取的幼芽外植體在BA和IAA的組合條件下,既能誘導(dǎo)愈傷組織的形成,又能誘導(dǎo)小球莖的產(chǎn)生,且產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地適中,呈顆粒狀,具有較好的分散能力.本試驗(yàn)條件下,取材培養(yǎng)的最佳時間為萌動期到旺盛生長期,因這段時間內(nèi)組織形成層活動活躍,細(xì)胞分裂較旺盛,材料易啟動.而開花期和倒苗期,植物組織進(jìn)入休眠狀態(tài),細(xì)胞活動減弱,材料的反應(yīng)很慢,不易誘導(dǎo)出愈傷組織.因此,取材時期在某種程