蠶豆病 生化設(shè)計實(shí)驗(yàn)

2011級臨床四大班第四實(shí)驗(yàn)室1,2小組組員：楊從德（201101171）王永波（201101168）武桂芬（201101170）王小花（201101167）試驗(yàn)時間:第十八周生化設(shè)計實(shí)驗(yàn)(yangcongde@)一、根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，初步判斷患兒是何種疾病？蠶豆病惡心、嘔吐、面色蒼白皮膚及鞏膜黃染紅細(xì)胞1.98×1012/L血紅蛋白53g/L血清總膽紅素85.5μmol/L尿蛋白（++）尿膽紅素(－)尿膽素原(+)尿液鏡下未見紅細(xì)胞黃疸紅細(xì)胞膜不完整，已破裂紅細(xì)胞含量少含量明顯增加血紅蛋白量減少排尿呈醬油樣色游離膽紅素增加溶血性黃疸蠶豆病腸肝循環(huán)增多蠶豆病簡介蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-PD）缺乏所導(dǎo)致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內(nèi)溶血。易發(fā)人群多見于兒童，男性患者約占90%以上。二、設(shè)計實(shí)驗(yàn)2、設(shè)計實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確診斷。貧血、黃疸有和無遺傳史無或有誘因（食用蠶豆、服用藥物、感染）體征：脾腫大、黃疸血常規(guī)檢查血清學(xué)檢查檢查HA的病因G6PD篩選試驗(yàn)G6PD確診試驗(yàn)Hb↓、網(wǎng)織紅細(xì)胞↑間接膽紅素↑尿膽原↑游離Hb↑結(jié)合珠蛋白↓懷疑其他HA,相應(yīng)病因檢測結(jié)果正常G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)紅細(xì)胞G6PD活性測定G6PD基因分析其他篩選試驗(yàn)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)初診或確診G6PD缺陷癥確診溶貧（血管內(nèi)溶血）確診G6PD做1項(xiàng)或2項(xiàng)做1項(xiàng)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)

G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)紅細(xì)胞G6PD活性測定篩選試驗(yàn)→確診試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理一、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理：在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細(xì)胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白還原酶的作用下又被還原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍(lán)作為遞氫體，還需要由G6PD參與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上述反應(yīng)。所以，G6PD缺陷癥的患者其MHb還原率下降（分光光度技術(shù)）亞鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白還原酶

NADPH(輔酶)亞甲藍(lán)(遞氫體)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)方向主要試劑：0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亞甲藍(lán)溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理鹽水、抗凝劑儀器：紫外分光光度計水浴箱、離心機(jī)、試管3支高鐵血紅單白還原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程取靜脈血1.8mL于抗凝管，混勻抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝劑+葡萄糖20mg)離心沉淀1000r/min15min調(diào)整血細(xì)胞∶血漿=1∶1，混勻→調(diào)整后全血（備用）1ml

0.18mol/L亞硝酸鈉1ml0.28mol/L葡萄糖溶液混勻→混合試劑（備用）

1ml0.14mmol/L亞甲基藍(lán)液高鐵血紅單白還原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程取試管3支,標(biāo)上A、B、S,按下表加入試劑高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)操作步驟混合試劑/mL0.01//生理鹽水/mL/0.01/0.18mol/L亞硝酸鈉-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL經(jīng)調(diào)整的全血/mL0.10.10.1來回?fù)u動15～20次,置37℃水浴箱靜置3h蒸餾水10.00ml10.00ml10.00ml試劑ABS高鐵血紅單白還原實(shí)驗(yàn)B管為空白管,在波長635nm處，測定“A”管及“S”管吸光度實(shí)驗(yàn)流程計算高鐵血紅蛋白還原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%

高鐵血紅單白還原實(shí)驗(yàn)二、G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同時使NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,后者在340nm波長紫外線照射下產(chǎn)生熒光（反應(yīng)原理如下圖）。所以將含有G6P和NADP等的混合試劑與血混勻后在0分鐘、5分鐘、10分鐘分別取1滴血到濾紙上，通過觀察濾紙上有熒光出現(xiàn)時間可判斷G6PD活性NADPNADPHG6P

6PGAG6PD實(shí)驗(yàn)原理試劑：反應(yīng)液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸鹽緩沖液3份和蒸餾水3份混勻儀器：長波紫外燈、濾紙、水浴箱G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)取試管，加10μl全血+100μl反應(yīng)液，混勻，取一滴于濾紙上（第一斑點(diǎn)）→作為對照將上液置于37℃水浴10min，再取一小滴滴于濾紙上（第二斑點(diǎn)）→實(shí)驗(yàn)組

晾干后，于長波紫外燈下（365nm）觀察結(jié)果，計時根據(jù)結(jié)果作出相應(yīng)診斷三、紅細(xì)胞G6PD活性測定實(shí)驗(yàn)原理：基本原理同G6PD熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。不同的是利用紫外光分光光度法定量測定酶活性，即每隔一分鐘在340nm波長測定孵育液中NADPH吸光度（測6次），求每分鐘吸光度增加的平均值，根據(jù)單位時間內(nèi)NADPH生成由于所用試劑及體系的不同。方法：①WHO推薦的Zinkham;②NBT定量法等實(shí)驗(yàn)原理試劑：生理鹽水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris緩沖液（pH7.5）、0.63mol/L氯化鎂溶液、33mmol/LG-6-P液儀器：紫外分光光度計水浴箱、離心機(jī)、試管實(shí)驗(yàn)流程取抗凝血2ml，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次（1500r/min離心10min）除去上清液和乳白層（白細(xì)胞和血小板）加等體積生理鹽水→紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min→

溶血液并測定其Hb濃度進(jìn)行比色（見下表）紅細(xì)胞G6PD活性測定G-6-PD活性測定的操作表（Zinkham法)試管對照管測定管NADP液（ml）0.10.1Tris液（ml）0.10.1氯化鎂液（ml）0.10.1蒸餾水（ml）0.680.58G6P液（ml）—0.1

37℃預(yù)熱溶血液（μl）2020紅細(xì)胞G6PD活性測定立即340nm處測吸光度，以對照管調(diào)零，37℃恒溫，每分鐘觀察1次，記錄吸光度的變化實(shí)驗(yàn)流程計算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)△A/min:每min吸光度的平均變化值1000/6.22:為微摩爾消光系數(shù)1020/20:總?cè)萘颗c溶血液的量之比；實(shí)驗(yàn)流程紅細(xì)胞G6PD活性測定結(jié)果分析方法一、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)：正常值：MHb還原率>=75%，臍血>=77%臨床診斷：純合子和半合子（XY）患者：MHb還原率<30%臍血<40%雜合子患者：MHb還原率<31%~74%臍血<41%~76%二、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)

正常人：0min斑點(diǎn)無熒光，5-10min出現(xiàn)，10min熒光最強(qiáng)臨床診斷：輕度缺陷者：0-10min熒光很弱或不出現(xiàn)中度缺陷者：10-30min出現(xiàn)熒光嚴(yán)重缺陷者：30min內(nèi)不出現(xiàn)熒光結(jié)果分析方法三、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定G6PD缺陷者：G6PD活性較正常平均值低40%以上即可作出診斷

方法正常值范圍WHO推薦的Zinkham(12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推薦的Glock與McLoan法（8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法（13.1~30.0）NBT單位Chapman和Dern法（2.8~7.31）IU/gHb(25℃)結(jié)果分析方法三、從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果★細(xì)胞膜的破壞★膽紅素的異常

紅細(xì)