第五章 克隆基因的表達(dá)

《基因工程概論》第一章導(dǎo)論第二章基因操作的工具酶第三章基因克隆的載體第四章基因克隆的策略第五章克隆基因的表達(dá)第六章基因工程的基本技術(shù)第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過(guò)程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素1、基因表達(dá)的基本過(guò)程1、基因表達(dá)的基本過(guò)程基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過(guò)程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，目的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；然后，tRNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,transferRNA）將各種氨基酸運(yùn)送到核糖體并按照mRNA的密碼子順序?qū)⒏鞣N氨基酸連接成特定的氨基酸序列(translation)最終得到基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）。第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過(guò)程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素Transcription(轉(zhuǎn)錄):

makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.

轉(zhuǎn)錄的具體過(guò)程轉(zhuǎn)錄的具體過(guò)程Antisensestrand有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Groupsofgenescodingforrelatedproteinsarearrangedinunitsknownasoperons.Anoperonconsistsofanoperator,promoter,regulator,andstructuralgenes.Theregulatorgenecodesforarepressorproteinthatbindstotheoperator,obstructingthepromoterofthestructuralgenes.Theregulatordoesnothavetobeadjacenttoothergenesintheoperon.Iftherepressorproteinisremoved,transcriptionmayoccur.半乳糖苷酶滲透酶轉(zhuǎn)乙?；窸peronsareeitherinducibleorrepressibleaccordingtothecontrolmechanism.Seventy-fivedifferentoperonscontrolling250structuralgeneshavebeenidentifiedforE.coli.Bothrepressionandinductionareexamplesofnegativecontrolsincetherepressorproteinsturnofftranscription.

啟動(dòng)子（promoter）：在基因序列中，標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始的可被RNA聚合酶識(shí)別的位點(diǎn)(DNA區(qū)段)，一般位于基因的上游。

終止子（terminator）：位于基因的編碼序列之外（一般在下游）的一段標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄停止的RNA聚合酶識(shí)別位點(diǎn)。有效轉(zhuǎn)錄的基本條件Prokaryoticgeneregulationdiffersfromeukaryoticregulation,butsinceprokaryotesaremucheasiertoworkwith,wefocusonprokaryotesatthispoint.

PromotersaresequencesofDNAthatarethestartsignalsforthetranscriptionofmRNA.Terminatorsarethestopsignals.mRNAmoleculesarelong(500-10,000nucleotides).

第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過(guò)程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素TheGeneticCodeTocodeforthe20essentialaminoacidsageneticcodemustconsistofatleasta3-baseset(triplet)ofthe4bases.Ifoneconsidersthepossibilitiesofarrangingfourthings3atatime(4X4X4),weget64possiblecodewords,orcodons(a3-basesequenceonthemRNAthatcodesforeitheraspecificaminoacidoracontrolword).ThegeneticcodewasbrokenbyMarshallNirenbergandHeinrichMatthaei,adecadeafterWatsonandCrick'swork.Thegeneticcodeconsistsof61amino-acidcodingcodonsandthreeterminationcodons,whichstoptheprocessoftranslation.Thegeneticcodeisthusredundant(degenerateinthesenseofhavingmultiplestatesamountingtothesamething),with,forexample,glycinecodedforbyGGU,GGC,GGA,andGGGcodons.正確翻譯的基本條件ThegeneticcodeMessengerRNA(mRNA)istheblueprintforconstructionofaprotein.TransferRNA(tRNA)isthetruckdeliveringtheproperaminoacidtothesiteattherighttime.tRNAwillforma"cloverleaf"structureduetocomplementarybasepairing.Atthetopofthelargelooparethreebases,theanticodon,whichisthecomplementofthecodon.Thereare61differenttRNAs,eachhavingadifferentbindingsitefortheaminoacidandadifferentanticodon.Ribosomesaretheorganelle(inallcells)whereproteinsaresynthesized.Theyconsistoftwo-thirdsrRNAandone-thirdprotein.Ribosomesconsistofasmall(inE.coli,30S)andlarger(50S)subunits.ThelengthofrRNAdiffersin

each.The30Sunithas16SrRNAand21differentproteins.The50Ssubunitconsistsof5Sand23SrRNAand34differentproteins.ThesmallersubunithasabindingsiteforthemRNA.

ThelargersubunithastwobindingsitesfortRNATranslationistheprocessofconvertingthemRNAcodonsequencesintoanaminoacidsequence.Theinitiatorcodon(AUG)codesfortheaminoacidN-formylmethionine(f-Met).NotranslationoccurswithouttheAUGcodon.f-Metisalwaysthefirstaminoacidinapolypeptidechain,althoughfrequentlyitisremovedaftertranslation.TheintitatortRNA/mRNA/smallribosomalunitiscalledtheinitiationcomplex.Thelargersubunitattachestotheinitiationcomplex.Aftertheinitiationphasethemessagegetslongerduringtheelongationphase.NewtRNAsbringtheiraminoacidstotheopenbindingsiteontheribosome/mRNAcomplex,formingapeptidebondbetweentheaminoacids.ThecomplexthenshiftsalongthemRNAtothenexttriplet,openingtheAsite.ThenewtRNAentersattheAsite.WhenthecodonintheAsiteisaterminationcodon,areleasingfactorbindstothesite,stoppingtranslationandreleasingtheribosomalcomplexandmRNA.Oftenmanyribosomeswillreadthesamemessage,astructureknownasapolysomeforms.Inthiswayacellmayrapidlymakemanyproteins.正確翻譯的基本條件1、具備起始密碼子2、具備終止密碼子3、具有正確的閱讀框基因表達(dá)的基本過(guò)程第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件1、基因表達(dá)的基本過(guò)程2、有效轉(zhuǎn)錄的基本條件3、正確翻譯的基本條件4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素4、影響克隆基因表達(dá)效率的因素一般而言，所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度、DNA的轉(zhuǎn)錄其始序列、密碼子的選擇、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的終止、基因的拷貝數(shù)等都會(huì)在一定程度上影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響大多數(shù)大腸桿菌啟動(dòng)子都含有兩種保守區(qū),即-10區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄其始位點(diǎn)上游5-10bp，故稱為-10區(qū)，序列為5’--TTGACA)和-35區(qū)(位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25bp處，一般有10bp組成，故稱為-35區(qū)，5’--TATAAT)。當(dāng)然，實(shí)際的啟動(dòng)子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動(dòng)子的這兩個(gè)區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動(dòng)子的表達(dá)能力也就越強(qiáng)。另外，這兩個(gè)保守區(qū)間的距離也是影響啟動(dòng)子強(qiáng)度的重要因素，即這個(gè)間距越是接近于17bp，啟動(dòng)子的活性就越強(qiáng)。b.翻譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響

mRNA的有效翻譯依賴于核糖體和其的穩(wěn)定結(jié)合，大腸桿菌的mRNA序列中，核糖體的結(jié)合位點(diǎn)是起始密碼子AUG和其上游的SD序列。所謂SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一種位于位于起始密碼子上游的一段保守序列，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和翻譯起始所必需。一般SD序列的長(zhǎng)度約為3-9bp，位于起始密碼子上游3-11堿基的位置，它與16S核糖體RNA的3‘端互補(bǔ)，控制了翻譯的起始。５’--AGGAGGUXXXAUG---mRNA３’AUUCCUCCACUAG-----16SrRNA3’末端c.啟動(dòng)子與克隆基因間的距離對(duì)基因表達(dá)的影響

研究表明啟動(dòng)子和目的基因間的距離對(duì)基因的表達(dá)效率影響很大，所以在構(gòu)建新的表達(dá)載體時(shí)要考慮到這儀因素的影響。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的終止子序列，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量的大量消耗，或是形成不應(yīng)有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終影響的目的基因的表達(dá)效率。PromoterSDATGGeneTerminatorTAAmRNA第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建一、原核表達(dá)真核基因的困難二、構(gòu)建原核表達(dá)載體的策略三、常用于原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子一、原核表達(dá)真核基因的困難細(xì)菌的RNA聚合酶不識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子；真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏SD序列，在原核細(xì)胞中不能結(jié)合到核糖體上；真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞沒(méi)有象真核細(xì)胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達(dá)出有功能的真核蛋白；表達(dá)的真核蛋白在原核細(xì)胞中很不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解破壞。二、構(gòu)建原核表達(dá)載體的策略將真核基因克隆到一個(gè)強(qiáng)大的原核啟動(dòng)子和SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。采用真核基因的cDNA序列作為構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因，這樣就解決了原核細(xì)胞沒(méi)有RNA剪接功能的問(wèn)題。構(gòu)建載體時(shí)，將真核基因插在幾個(gè)原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識(shí)別和降解，最后可以將融合多肽切除。三、常用于原核表達(dá)的啟動(dòng)子Lac啟動(dòng)子是β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動(dòng)子可以被IPTG誘導(dǎo)，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導(dǎo)物就可以誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。Trp啟動(dòng)子是編碼參與色氨酸生物合成的幾種酶的基因簇的上游調(diào)控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被β-吲哚丙烯酸（β-

IAA）誘導(dǎo)。Tac啟動(dòng)子是一種由Lac和Trp啟動(dòng)子雜合而成的啟動(dòng)子，其強(qiáng)度得到了很大的提高，也可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。λPL啟動(dòng)子是負(fù)責(zé)λDNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一，是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子。第五章克隆基因的表達(dá)第一節(jié)基因表達(dá)的基本條件第二節(jié)原核表達(dá)載體的構(gòu)建第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)第三節(jié)克隆基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)一、真核基因表達(dá)的特點(diǎn)二、用于植物表達(dá)的啟動(dòng)子類型三、Ti質(zhì)粒及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化真核基