第四章 抗體制藥專題

第四章抗體制藥專題

第一節(jié)抗體結(jié)構(gòu)與治療作用

抗體結(jié)構(gòu)抗原一類能刺激人或動物產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能在體內(nèi)和體外特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w抗原刺激人體或動物體的B細(xì)胞，由B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白?？贵w功能區(qū)：VH+VL→特異的抗原結(jié)合部位。CL+CH1→有L鏈與H鏈間S-S結(jié)合部位。CH2→補(bǔ)體結(jié)合位置CH3→固定組織細(xì)胞（單核、巨噬細(xì)胞等）Fab——木瓜蛋白酶水解IgG得到的兩個相同的片段，含有完整的輕鏈和重鏈的上端。與抗原結(jié)合，二價抗體Fc——木瓜蛋白酶水解IgG得到的重鏈下端。與補(bǔ)體結(jié)合抗體的治療作用1）抗腫瘤作用2）抗感染作用3）抗器官移植作用4）抗血栓形成5）解毒6）構(gòu)建獨(dú)特型疫苗7）免疫性疾病及其變態(tài)反應(yīng)性疾病治療分類多克隆抗體多種抗原決定族，多種抗體產(chǎn)生。

單克隆抗體單一抗原決定族產(chǎn)生的均一性抗體缺點：免疫原性，半衰期短，耙吸收差，生產(chǎn)復(fù)雜，價格貴

基因工程抗體抗體結(jié)構(gòu)功能與基因重組技術(shù)結(jié)合第二節(jié)單克隆抗體1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的Kohler和Milstein將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合后發(fā)現(xiàn)：

通過克隆化可使雜交細(xì)胞成為單純的細(xì)胞系，由此單克隆系就可以獲得結(jié)構(gòu)與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（McAb）簡單生產(chǎn)過程單克隆抗體的不足.鼠源單抗能夠特異識別抗原,但是在人體中不能有效激活補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)..鼠源單抗用于人體時常被人免疫系統(tǒng)識別,產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA).外源抗體在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除.第三節(jié)人源化單克隆抗體鼠單抗的人源化，是為了克服鼠源MAb的免疫原性而將其進(jìn)行改造，使之和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。人源化單克隆抗體技術(shù)前景目前進(jìn)入臨床階段的人源化單克隆抗體藥物約有100個,估計占研制中的生物技術(shù)藥物的25%.美國FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)的單克隆抗體有13種.1997年第一個用于治療淋巴瘤的人鼠嵌合型單抗Rituxan上市,該產(chǎn)品1998---2000的銷售額分別是1.5億美元,2.6億美元,4.2億美元.增長很快.抗體的人源化主要應(yīng)考慮到兩個基本的原則：一是應(yīng)保持或提高抗體的親和力和特異性；二是應(yīng)降低或基本消除抗體的免疫原性目前報道的人源化方法主要有:

嵌合表面重塑(resurfacing)重構(gòu)(reshapping)抗體功能片斷嵌合抗體第一代的抗體人源化是將鼠MAb的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體，由于這兩部分在空間結(jié)構(gòu)上相對獨(dú)立，其獨(dú)特的抗體親和力保持得很好，但因鼠單抗可變區(qū)的存在，應(yīng)用時仍有較強(qiáng)的HAMA反應(yīng)。嵌合抗體的產(chǎn)品實例1986年winter領(lǐng)導(dǎo)的小組把嵌合體中小鼠的成分削減到5-10%.形成了人化的鼠類單克隆,接著溫特對技術(shù)加以改進(jìn),把嵌合體技術(shù)轉(zhuǎn)化為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè).1994年EliLilly公司的產(chǎn)品Reporo是第一個獲準(zhǔn)上市的嵌合抗體----可以通過攻擊血小板上的一種受體蛋白質(zhì)靶,減少心血管病人形成血栓的危險.嵌合抗體從雜交瘤細(xì)胞中獲得抗體V區(qū)cDNA,克隆到重組了人抗體C區(qū)的載體中,轉(zhuǎn)化入動物細(xì)胞表達(dá)出人鼠嵌合抗體.改造后的抗體保留了原單抗特異結(jié)合的抗原V區(qū),去除了非人源序列(c區(qū)),表面重塑通常認(rèn)為,抗原上的抗原決定簇應(yīng)具殘基的運(yùn)動性和溶劑的可及性,多集中在抗原表面該法的原則是僅替換與人抗體差別明顯的區(qū)域,在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換重構(gòu)抗體重構(gòu)抗體是由異源抗體中和抗原結(jié)合相關(guān)殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的.通過置換三個發(fā)夾環(huán)的鼠抗體超變區(qū)(又稱互補(bǔ)決定區(qū),CDR),使構(gòu)成抗原結(jié)合部位的輕重鏈各3個CDR區(qū)是鼠源的,其余均為人源的抗體功能片段Fab片段抗體由完整的輕鏈和重鏈（VH+CH1)組成FV抗體由VH＋VL組成單鏈抗體VH＋Linker＋VL單域抗體VH或VL最小識別單位抗體單個CDR第三節(jié)抗體庫與基因工程抗體技術(shù)如何得到人抗體的目標(biāo)基因？噬菌體抗體庫技術(shù)(surfacedisplayphageantbody)核糖體展示技術(shù)轉(zhuǎn)基因/轉(zhuǎn)染色體動物技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù):用PCR擴(kuò)增抗體全套V區(qū)基因,重組到噬菌體載體,并通過與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白形成融合蛋白,使Fab或者ScFv表達(dá)在噬菌體表面,形成噬菌體抗體庫.采用親和層析將固相化抗原與抗體庫孵育,通過數(shù)次"吸附-洗脫-擴(kuò)增"篩選出特異性噬菌體抗體,感染大腸桿菌后增殖,表達(dá),活化,從而獲得大量特異性抗體.構(gòu)建方法:提取B淋巴細(xì)胞RNA,擴(kuò)增V區(qū)基因,用兩種內(nèi)切酶分別對純化的輕鏈PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切后分離純化,連接電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,即為輕鏈庫;分別對經(jīng)純化的重鏈PCR產(chǎn)物和輕鏈庫進(jìn)行雙酶切,純化回收后連接,電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,加入輔助病毒進(jìn)行培養(yǎng)離心取上清,加入PEG沉淀噬菌體顆粒,即為噬菌體抗體庫抗體庫篩選.將固相化抗原與抗體庫孵育,只有在其表面表達(dá)與抗原有高親和力抗體的噬菌體才能結(jié)合在抗原上將這些噬菌體洗脫下來,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增.將獲得的噬菌體顆粒在重復(fù)上述過程3-5次,從而使得噬菌體抗體的特異性加強(qiáng),數(shù)量增加.將最后一次富集后的噬菌體感染細(xì)菌鋪盤,挑去部分集落制備抗體,并用酶鏈免疫吸附分析鑒定,以篩選特異性噬菌體抗體..

RibosomedisplaytechnologyTheDisplayCycle

ThedisplayprocessusedbyDiscernaisremarkablyrobustandcanbesummarisedinthefollowingsequenceofseventechnicallysimplesteps:

1.Takegenesencodingtheprotein.

2.Amplifygenesusingstandardmethods.

3.Produceproteinstaggedwiththeirencodinggeneinvitro.

4.Affinitypurifyproteinsusinganappropriateligandorantigen.

5.Amplifythegenesencodingthepurifiedproteinsusingstandardmethods.

6.Clonegenesandexpressinbacteria.

7.Lysebacteriaandpurifyproteinsforuse.

DiscernArray?

DiscernArray?technologyisacombinationofPCRandcellfreesynthesiswhichallowsthehighspeedparallelsynthesisofantobodies.Thefinalstagesoftheprocesscanallowanarrayofantibodiestobeproduced.Inprincipalthetechnologycanbeappliedtoanytypeofprotein.

Features

1.DiscernArray?convertsPCRDNAintoanantobodyarrayin3hoursorless,withnocloningoradditionalproteinpurification.

2.DiscernArray?replacecloning,invivoexpressionsystemsandpurificationprocedures,avoidinginclusionbodies,aggregationordegradationassociatedwithbacterialexpression.

3.DiscernArray?canbemadeinhighthroughputformatbycarryingoutmultipletranscription/translationreactionsinparallel.

抗體庫技術(shù),在一定程度上較好的模擬了體內(nèi)抗體生成的三個重要環(huán)節(jié)1.多樣性的B細(xì)胞群體2,克隆選擇3親和力成熟如何生產(chǎn)基因工程抗體？基因工程抗體

特點：保留抗體的抗原結(jié)合能力、降低生產(chǎn)成本、易于大規(guī)模生產(chǎn)

基本原理：借助基因工程手段，將編碼Ab的基因重組到真核或原核表達(dá)載體上并進(jìn)行表達(dá)