單細(xì)胞測序在發(fā)育、癌癥和病理過程中的應(yīng)用

匯報(bào)人：孫振東日期：2021.1.26目錄：單細(xì)胞RNA測序發(fā)展的原因單細(xì)胞RNA測學(xué)的優(yōu)點(diǎn)單細(xì)胞RNA測序的目標(biāo)單細(xì)胞RNA測序工作流程及原理單細(xì)胞RNA測序的高通量方法單細(xì)胞RNA測序的試驗(yàn)設(shè)計(jì)單細(xì)胞RNA測序的數(shù)據(jù)分析單細(xì)胞RNA測序的挑戰(zhàn)單細(xì)胞RNA測序的應(yīng)用發(fā)展原因（1）不同的細(xì)胞表達(dá)不同的基因集合，有產(chǎn)生不同的蛋白組分和細(xì)胞表型，進(jìn)而有不同的分子效應(yīng)。（2）傳統(tǒng)的基因表達(dá)研究是對大量的細(xì)胞池進(jìn)行分析，雖然能夠獲得大量的RNA，但是在分析精度上存在缺陷，這種方法得到只是一個細(xì)胞群的平均表達(dá)譜，不能具體到特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)情況。Eg癌癥和疾病中的某類細(xì)胞（3）在器官發(fā)育中也存在細(xì)胞的異質(zhì)性，對祖細(xì)胞群的基因表達(dá)分析，不能確定促使祖細(xì)胞向下游分化的具體信號途徑。（4）相比于累加分析，單細(xì)胞測序也能加深對細(xì)胞行為的理解優(yōu)點(diǎn)（1）可以區(qū)分細(xì)胞群中各類細(xì)胞的分子類型，Eg受體、TF、GF、轉(zhuǎn)運(yùn)體等（2）有助于理解組織學(xué)上相似、相鄰細(xì)胞是如何分化的（3）有利于進(jìn)一步了解先前的已知細(xì)胞的特征，并鑒定出新的細(xì)胞類型（4）提高我們對常態(tài)和病態(tài)生理過程的認(rèn)知，開發(fā)出新的治療方法（5）提供人體所有類型細(xì)胞的基因表達(dá)模式的細(xì)節(jié)圖譜目標(biāo)

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ChanZuckerbergInitiativeAtlasProject工作流程與原理工作流程與原理組織單細(xì)胞懸液富集分離單細(xì)胞裂解制備基因文庫擴(kuò)增測序數(shù)據(jù)分析及可視化機(jī)械分離/酶解/組合方法FACS/磁珠分離微流體技術(shù)微孔板法工作流程與原理工作流程與原理工作流程與原理高通量方法

因?yàn)閱渭?xì)胞RNA測序需要分析大量的細(xì)胞和RNA，所以高通量測序方法的引入，極大的推動了單細(xì)胞測序的發(fā)展。

如：

流體C1微流控系統(tǒng)：1天的時間內(nèi)，進(jìn)行1次循環(huán)讀取96個細(xì)胞；

高通量液體IFC芯片：一次可測定800個細(xì)胞高通量方法（1）微滴法（代替了微室法）

原理：微滴是由油包裹，有兩微升的體積，其內(nèi)部含有一個單細(xì)胞和一個含有一組特異條碼寡核苷酸的珠子，細(xì)胞裂解之后，寡核苷酸和釋放的mRNA雜交。

S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018高通量方法（1）微滴法（代替了微室法）

Drop-seq技術(shù)：珠子、附著的寡核苷酸和退火的mRNAs都從微滴中釋放出來，并結(jié)合到一個單管中，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

鉻微滴法和InDrop技術(shù)：水凝膠珠溶解在微滴中，釋放寡核苷酸與mRNAs雜交，并且在微滴中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。高通量方法（1）微滴法（代替了微室法）鉻微滴法較Drop-seq方法的優(yōu)勢：

①鉻微滴法可檢測單個細(xì)胞中更多的基因，獲取的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

②因?yàn)殂t微滴可以盡可能將更多的單細(xì)胞包裹到含有珠子的微滴中，所以它能提供待分析細(xì)胞群中更多細(xì)胞的基因表達(dá)譜。

③便于啟動和操作

鉻微滴法較Drop-seq技術(shù)的劣勢：

所用試劑成本高。高通量方法（2）非微流體法a.微孔板法

通過簡單分揀或流式熒光細(xì)胞分選技術(shù)，把任意大小的單細(xì)胞放置在微孔板上進(jìn)行單細(xì)胞的RNA測序分析。

各種擴(kuò)增方法可以和微孔板法聯(lián)合使用，比如：SMARTseq2chemistry,Cel-seq,MARS-seqandSTRT-seq。Hanetal.,Cell2018高通量方法（2）非微流體法

微孔板法的優(yōu)點(diǎn)：

①對細(xì)胞的大小不敏感。對細(xì)胞敏感程度由大到小的技術(shù)排序：流體系統(tǒng)>微滴法>微孔板法

②需要的設(shè)備簡單，啟動成本低。

③cDNA序列的全覆蓋。高通量方法（2）非微流體法b.CytoSeq技術(shù)：

優(yōu)點(diǎn)：可以待分析細(xì)胞的數(shù)量自由調(diào)控微孔的數(shù)量。c.SPLiT-seq技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：減少設(shè)備需求的數(shù)量，并降低文庫構(gòu)建時的成本。試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮因素：

（1）細(xì)胞數(shù)量

（2）每個細(xì)胞的數(shù)據(jù)讀取

（3）生物復(fù)制。

雖然用于分析的細(xì)胞數(shù)量越多越好，但成本也會增高。不同技術(shù)對單個細(xì)胞序列讀取數(shù)量和質(zhì)量是不一樣的，應(yīng)依據(jù)細(xì)胞之間的相似度進(jìn)行選擇數(shù)據(jù)分析（1）表達(dá)基因的鑒定

將scRNA-seq數(shù)據(jù)去卷積，根據(jù)條形碼的特異性匹配細(xì)胞，確定擴(kuò)增過程中，cDNA的比例與擴(kuò)增前逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果相一致，最終基因表達(dá)讀取的次數(shù)就代表了基因表達(dá)的模式。數(shù)據(jù)分析（2）質(zhì)控

為確保用于scRNA-seq分析的細(xì)胞正常，應(yīng)進(jìn)行質(zhì)控，移除異常細(xì)胞可以是數(shù)據(jù)結(jié)果更加合理。

①被認(rèn)為應(yīng)當(dāng)表達(dá)的基因表達(dá)數(shù)量少的細(xì)胞，會弱化數(shù)據(jù)集

②有高比例的線粒體DNA被讀取的細(xì)胞，可能死掉了，胞膜通透性增加，是胞質(zhì)RNA泄露。

③因?yàn)榧t細(xì)胞中有大量血紅蛋白的表達(dá)，也應(yīng)當(dāng)被移除。數(shù)據(jù)分析（2）質(zhì)控Liaoetal.,scientificdata2020數(shù)據(jù)分析（3）分析策略a.降維：通過各種預(yù)測模型算法使高維數(shù)據(jù)變?yōu)榈途S數(shù)據(jù)b.重復(fù)聚類：優(yōu)點(diǎn)：

①可以基于復(fù)雜的基因表達(dá)特征分類，不局

限于細(xì)胞特異性的標(biāo)記基因；

②可以克服關(guān)鍵基因遺漏帶來的問題。

數(shù)據(jù)分析重復(fù)聚類分析將細(xì)胞類型逐漸進(jìn)行細(xì)化，但需要注意不能基于噪音聚類（3）分析策略b.重復(fù)聚類：S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018數(shù)據(jù)分析（3）分析策略

b.重復(fù)聚類：

Liaoetal.,scientificdata2020為評判分類的合理性，需要參照基因表達(dá)的熱圖，新細(xì)胞亞型間基因表達(dá)模式的差別還需要正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證（eg免疫熒光、FISH（原位熒光雜交）等）。數(shù)據(jù)分析（4）數(shù)據(jù)分析軟件SeuratSCDESinceraRaceIDAltAnalyzeHiLoadG-HCMonocleRCBackspinSCellWishbonePagodaWanderlustscLVMDPTNMFp-Creode挑戰(zhàn)（1）有限的實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)問題：每個細(xì)胞中含有總RNA量為10皮克，mRNA量為0.1皮克。解決方法：擴(kuò)增擴(kuò)增問題：cDNA在擴(kuò)增過程中是非線性的，使得序列的讀取數(shù)量不能真實(shí)的反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況。解決方法：UMI：uniquemolecularidentifier挑戰(zhàn)（2）單細(xì)胞的捕獲

獲取單細(xì)胞的方法：①微操作：可以保證分理出的是單細(xì)胞，但勞動量大不能達(dá)到高通量的要求。②激光捕獲顯微解剖（LCM）：可獲得一些空間上的信息，但依舊是低通量。理想做法：使用LCM干凈地捕獲到一個細(xì)胞的內(nèi)容物，而不損傷RNA。③FACS（流式熒光細(xì)胞分選儀）：高通量，可用于少量樣本的富集。④scRNA-seq技術(shù)挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：

優(yōu)點(diǎn)：高通量，可同時檢測大量細(xì)胞，在初始組織中的每一種細(xì)胞都可以被檢測到，且不需要細(xì)胞特異性的標(biāo)簽。挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：

技術(shù)問題：

（1）在分離細(xì)胞中，會使空間信息丟失，不能重構(gòu)單細(xì)胞分辨率的三維基因表達(dá)圖譜。

解決方法：借助生物信息學(xué)的手段，根據(jù)已知特定位置的基因表達(dá)特征來確定空間位置。新類型細(xì)胞空間位置通過原位雜交和免疫熒光技術(shù)來確定。挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：技術(shù)問題：（2）組織中各類細(xì)胞的形態(tài)，狀態(tài)或?qū)Ψ蛛x環(huán)境的耐受程度不同，獲取地單細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞類型的比例能否很好地反應(yīng)初始組織的情況。

解決方法：盡可能采取溫和的方式處理組織，或在制備懸浮液的過程中加入細(xì)胞保護(hù)液挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：技術(shù)問題：

（3）酶解組織獲取單細(xì)胞的過程中，為響應(yīng)新的，且酶解溫度是37℃的環(huán)境，細(xì)胞會改變表達(dá)模式（Eg：FOS和JUN家族的基因會表達(dá)上調(diào)）。這種基因表達(dá)的人工產(chǎn)物會影響單細(xì)胞RNA測序的最終數(shù)據(jù)。挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：

解決方法：

①用機(jī)械均化制成的細(xì)胞核中進(jìn)行RNA-seq。核RNA-seq技術(shù)問題：a.只有少部分的胞質(zhì)RNA在細(xì)胞核中，因此技術(shù)產(chǎn)生的噪音也會增加，人們也懷疑核中的RNA比重是否能夠真實(shí)的反應(yīng)整個細(xì)胞的RNA。

b.核中的RNA大部分是未成熟的，還含有內(nèi)含子，使數(shù)據(jù)分析也變十分復(fù)雜。挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：

解決方法：

②在細(xì)胞裂解過程中，使用轉(zhuǎn)錄抑制。

抑制劑問題：

a.轉(zhuǎn)錄抑制劑吸收慢，且細(xì)胞為了吸收抑制劑，會表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)子，也會改變基因表達(dá)譜。

b.該方法只抑制了RNA的合成并未考慮RNA的分解帶來的影響。挑戰(zhàn)scRNA-seq技術(shù)：

解決方法：

③使用冷適應(yīng)的蛋白質(zhì)酶分離單細(xì)胞，可以很好的抑制基因表達(dá)模式因處理方式的改變。挑戰(zhàn)（3）噪音

①生物噪音（20%）

基因并不是以一個穩(wěn)態(tài)的方式進(jìn)行表達(dá)的，它具有搏動性和爆炸的特點(diǎn)，即只在一個短時間內(nèi)進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄，這意味著不同時刻特定細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)量是波動變化的。挑戰(zhàn)（3）噪音

②轉(zhuǎn)錄水平的測定方法（80%）

scRNA-seq對于低水平表達(dá)的基因，是很難檢測到的。逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增的無效性也增加了技術(shù)噪音。

解決辦法：

無監(jiān)督聚類。S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018應(yīng)用（1）發(fā)育①多譜系啟動

胰腺：在發(fā)育過程中，有些單細(xì)胞表達(dá)多種未來可能分化的細(xì)胞類型的基因。應(yīng)用

腎囊泡的scRNA-seq分析表明，細(xì)胞會處于譜系決策的中間階段.。S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018（1）發(fā)育①多譜系啟動應(yīng)用（1）發(fā)育

②器官發(fā)育圖譜

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜可用于創(chuàng)建器官發(fā)育的高分辨率基因表達(dá)圖譜。這種圖譜將定義不同發(fā)育階段每個細(xì)胞類型表達(dá)的所有轉(zhuǎn)錄因子、生長因子和受體，全面表征轉(zhuǎn)錄過渡狀態(tài)。

策略：分離發(fā)育器官的細(xì)胞→進(jìn)行高通量的scRNA-seq分析→無監(jiān)督聚類→空間重建

早期腎臟發(fā)育、肺發(fā)育應(yīng)用（1）發(fā)育②器官發(fā)育圖譜早期肝臟發(fā)育膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子（GDNF）來自帽間充質(zhì)腎祖細(xì)胞應(yīng)用（1）發(fā)育②器官發(fā)育圖譜

基質(zhì)細(xì)胞才是GDNF因子的重要來源應(yīng)用（1）發(fā)育②器官發(fā)育圖譜肺發(fā)育表征了雙潛能細(xì)胞，鑒定出新的細(xì)胞類型標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了發(fā)育多階段中的多種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，并定義了這些細(xì)胞的全基因表達(dá)模式。應(yīng)用（3）發(fā)育③器官和類器官發(fā)育的意義

對Nkx2.5雜合缺失的小鼠心臟分析，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的串?dāng)_是心內(nèi)膜細(xì)胞成熟所必需的。應(yīng)用scRNA-seq研究iPSCs在形成肝芽時基因表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)多能基因的逐漸下調(diào)，控制內(nèi)胚層形成的基因的上調(diào)。（3）發(fā)育③器官和類器官發(fā)育的意義應(yīng)用

移植的肝臟器官進(jìn)行scRNA-seq分析表明，肝臟血管生成的過程中缺氧、炎癥和基質(zhì)重塑的基因也發(fā)揮作用。（3）發(fā)育③器官和類器官發(fā)育的意義應(yīng)用（2）癌癥