切片主要步驟

切片法主要步驟1、取材與固定（1）取材：從動物體取下所需的器官材料。取材的動物要健康，材料愈新鮮愈好，應(yīng)在致死后立即取材，防止組織細胞自溶變性；取材的器械要鋒利；所取材料力求小而?。ㄒ圆怀^0.5cm為宜），不能擠壓和損傷。（2）固定：將所取的材料立即投入固定液中，目的是使組織蛋白迅速凝固，使細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和成分不再發(fā)生變化，保持組織細胞與活體相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，固定后的組織塊變硬，便于進一步處理。常用的固定劑有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。實驗室常用Bouin固定液，固定時間為12~24小時，其固定的組織塊不需進行水洗，可直接進行脫水。2、脫水與透明（1）脫水：固定后的組織塊內(nèi)含有的大量水分要徹底脫去，以便石蠟的浸入。常用的脫水劑為乙醇，脫水過程必須循序漸進，從低濃度開始，逐步升高，使組織塊中的水分逐漸被乙醇所取代。具體操作為：Bouin固定液固定的組織塊可直接進入70％的乙醇進行脫水，時間12小時左右。（若材料暫不制片，可保存于70％乙醇中。）然后將組織塊依次移入85%乙醇（I）、（II）各8-12小時，一95%乙醇（I）、（II）各2小時，一100%乙醇（I）、（II）各1小時。因無水乙醇對組織有脆化作用，故在無水乙醇中時間不能超過2小時（2）透明：100%酒精+二甲苯（1:1）30-40分鐘，二甲苯（I）15分鐘一二甲苯（II）15分鐘（易脆的組織可省略）。二甲苯的收縮性強，極易使組織變脆，透明時間根據(jù)不同的組織適當調(diào)整。3透蠟：二甲苯+石蠟（1:1）30分鐘，石蠟（I）40分鐘一石蠟（II）30分鐘浸蠟是將包埋劑取代二甲苯滲透入整個組織的過程,通常在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度應(yīng)該設(shè)置成高于石蠟熔點2?3°C。浸蠟的時間長短根據(jù)不同的組織器官適當調(diào)整。4包埋5切片：將凝固的蠟塊修整成合適的方塊，上下邊要平行，并固定在小木塊上，切片厚度6-12um，—般7-8um。切片刀傾斜角一般以20—30度為宜，切片時力要均勻一致，以每分鐘40-50轉(zhuǎn)為宜。夏季切片時,為保持蠟塊硬度，可把蠟塊放于冰柜中,切片時再取出；膠質(zhì)成分較多的組織蠟塊,切片時可以用毛筆沾水往冷卻過的蠟塊滴加后再切片,以保證切片的完整性。如果發(fā)現(xiàn)切片破碎可能的原因有:組織過硬變脆,可能是由于脫水時間不適當,可先用溫水潤澤,再用冰硬化,便可較順利地切片；也可能由于浸蠟時溫度過高,造成組織過硬。6貼片：用潔凈的純凈水（易掉片的用甘油蛋白）貼片，放在45-50C左右（比石蠟的熔點略低，根據(jù)氣溫適當調(diào)整）左右烘片臺展平，入50C的干燥箱中烘干備用。7染色：二甲苯脫蠟（I）（10-20分鐘，可長時間）一二甲苯脫蠟（II）（10-20分鐘，可長時間）一以下每步2-5分鐘，也可長時間二甲苯：無水酒精1：1一無水酒精（I）—95%酒精一90%酒精一80%酒精一70%酒精一蒸餾水一蘇木精或伊紅染液（20-24分鐘）一自來水沖洗一蒸餾水（2-5分鐘）—1%鹽酸酒精（70%酒精＋1%鹽酸，在其中蘸取幾下）（然后蒸餾水中沾洗幾次，清除鹽酸，防止下一步中和堿水）—1%堿水（3-5秒）至組織出現(xiàn)藍色（目的：顯藍）—蒸餾水（2分鐘）—70%酒精（2分鐘）—80%酒精（2分鐘）—90%酒精（2分鐘）—95%酒精（2分鐘）—0.5－1%的伊紅染液復(fù)染（幾秒至數(shù)分鐘，根據(jù)伊紅濃度和組織不同而定，注意染色時間不能太長,3-5秒）一95%酒精（I）（分色2分鐘

或更長，至胞漿和結(jié)締組織等成桃紅色）一95%酒精（II）（2分鐘）一無水酒精（I）（2分鐘）一無水酒精（II）（2分鐘）一二甲苯（I）（2分鐘）一二甲苯（II）（2分鐘）不同的生物及不同的組織以及相同組織的不同生理階段對染料的親和力都有差異，所以分色和藍化時間需要摸索可在顯微鏡下觀察。染色結(jié)果細胞核藍紫色，膠原纖維、肌纖維、嗜酸性顆粒桃紅色，胞漿桃紅色，彈性纖維明亮桃紅色。8封固：中性樹膠用二甲苯稀釋，以能用吸管吸起為準，先將蓋玻片一側(cè)放置在滴有中性樹膠的組織切片上,隨后緩慢放下并將空氣完全排除,避免留下氣泡。斜面放置晾干。9觀察和照相：在顯微鏡下觀察，對好的視野拍照，做好記錄。Cinin4l—IIH"h|riIh1沖IMIA.M[4thIPLLA-LlllMJKII*I和ItAPt.LA-C'DJlMPk〔15町19]054.10DOX-HCLPELA-CD/DOX膠束.HA-PI-1A-ClVI>OX膠電給藥4Hh以及10天后各臟器的近紅外展像圖片(b)-?-controlOCXI亠一DOX-NPb.???10 302S903BTinwWTlmt(63-18腫/fffti筑刃片W),腫fii休枳(訕公蘇舉體J￡(c>既時何的變化掃紅Pig.J-18imagesofthetumors(n)removedfrommiceattheendpointoftheresearehTumur-jcruwih

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