lr2、lr4和lr9在大鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中的表達(dá)

lr2、lr4和lr9在大鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中的表達(dá)

樣本受體（tr）是一個(gè)天然免疫系統(tǒng)的膜受體。它可以與病因?qū)W相關(guān)的分子結(jié)合，開始信息轉(zhuǎn)化，然后生成序列因子（nf）引起b國激活，并引起炎癥介質(zhì)的出現(xiàn)。因此，它是天然免疫和得少性免疫的聯(lián)系，可以在一些革蘭氏疾病中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠結(jié)腸炎模型結(jié)腸組織中TLR2、TLR4和TLR9的表達(dá),并結(jié)合疾病活動(dòng)度、大體損傷評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分和超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)活性進(jìn)行分析,旨在探討三者在炎癥性腸病(IBD)發(fā)病機(jī)制中的作用。材料和方法一、材料表面1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠20只,體質(zhì)量200~230g,雌雄各10只,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于25℃凈化實(shí)驗(yàn)室內(nèi),混合飼料喂養(yǎng),自由飲水。2.主要試劑和儀器2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBSSigma公司),SOD、MPO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),TLR2、TLR4、TLR9兔抗鼠多克隆抗體(SantaCruz公司),免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),TLR2、TLR4、TLR9引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司),Trizol試劑(Gibco公司),M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA聚合酶(Promega公司)。二、方法1.基肥模型的制作20只大鼠隨機(jī)分為模型組和正常對(duì)照組,每組10只。參照Hibi等報(bào)道的方法制備大鼠結(jié)腸炎模型。大鼠禁食24h,戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉,將聚乙烯導(dǎo)管插入結(jié)腸內(nèi)距肛門口7~8cm處,以注射器注入100mg/kgTNBS+等體積無水乙醇灌腸,倒置30s,蘇醒后正常飲食。正常對(duì)照組大鼠予等體積0.9%NaCl溶液灌腸。2.結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)cmdi的測(cè)定造模后第2d起每天觀察和評(píng)價(jià)大鼠體質(zhì)量、腹瀉和肉眼血便情況,于第10d計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)以評(píng)估疾病活動(dòng)度(見表1)。第10d處死大鼠,取肛門至回盲部腸段,沿腸系膜緣縱行剖開,于體示顯微鏡(解剖鏡)下觀察結(jié)腸大體形態(tài),參照王皓等采用的大體損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)。每只大鼠于遠(yuǎn)端結(jié)腸、橫結(jié)腸和升結(jié)腸各取一塊約2mm×10mm的組織標(biāo)本,另在嚴(yán)重炎癥或潰瘍處至少取一塊組織標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,由病理科醫(yī)師參照王皓等采用的組織學(xué)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察、評(píng)分,結(jié)果取各部位標(biāo)本評(píng)分的均值。3.黃系mpo活性測(cè)定按上文所述方法取結(jié)腸組織標(biāo)本,以0.9%NaCl溶液(SOD)或勻漿介質(zhì)(MPO)手工勻漿,制成1%(SOD)和5%(MPO)勻漿。以黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,以紫外分光光度法測(cè)定MPO活性,具體步驟參照試劑盒說明書。結(jié)果取各部位標(biāo)本測(cè)定值的均值。4.酶標(biāo)鏈霉親和素混合物pbs采用SP法。各部位組織切片脫蠟、封閉、抗原熱修復(fù);滴加TLR2、TLR4和TLR9兔抗鼠多克隆一抗(稀釋度均為1∶100);滴加二抗酶標(biāo)鏈霉親和素復(fù)合物;顯色;復(fù)染;封片。每次檢測(cè)均以0.01mol/LPBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用Image-ProPlus5.1圖像分析軟件(MediaCybernetics),以胞質(zhì)和胞膜染成棕黃色為陽性細(xì)胞,每一樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400),計(jì)數(shù)每平方毫米內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù),以x±s表示。5.逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測(cè)總rna表達(dá)分別取50~100mg各部位結(jié)腸黏膜組織,搗碎,加入1mlTrizol溶液,勻漿;加入200μl氯仿,劇烈振蕩15s,12000×g離心15min;取上清液0.5ml,加入異丙醇0.5ml,12000×g離心10min;棄上清液,加入750ml/L乙醇洗沉淀,晾干。取4μl總RNA行逆轉(zhuǎn)錄,取2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增。各引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小見表2。15g/L瓊脂糖凝膠電泳,PCR產(chǎn)物以培清JS-300凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)、OlympusDPController軟件和Image-ProPlus5.1圖像分析軟件行光密度分析,目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量以目的基因光密度值與內(nèi)參照基因光密度值的比值表示。三、兩組患者t檢驗(yàn)和pearson相關(guān)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以x±s表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),各指標(biāo)間相關(guān)性的分析采用Pearson相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、新時(shí)導(dǎo)致“爭議”造模后1~2h大鼠即出現(xiàn)肉眼血便,1d后出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、厭食、大便次數(shù)增多、軟便或稀便,3d時(shí)達(dá)高峰,以后逐漸好轉(zhuǎn)。造模10d后DAI較正常對(duì)照組顯著升高(見表3)。二、各組小鼠cmdi的比較造模10d后,模型組結(jié)腸組織解剖鏡下有不同程度的充血、水腫、糜爛、出血和淺小潰瘍形成,以結(jié)腸下段為重,CMDI較正常對(duì)照組顯著升高;光學(xué)顯微鏡下結(jié)腸組織中可見大量中性粒細(xì)胞、部分淋巴細(xì)胞和少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,累及黏膜下層和固有層,并可見隱窩膿腫和黏膜肌層增厚,組織學(xué)評(píng)分顯著高于正常對(duì)照組(見表3)。三、sod和pmo的活性造模10d后,結(jié)腸組織SOD活性較正常對(duì)照組顯著降低,MPO活性較正常對(duì)照組顯著升高(見表3)。四、tlr9表達(dá)正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜下層和固有層炎性細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)僅有少量TLR2、TLR4表達(dá),未見TLR9表達(dá);模型組黏膜下層和固有層TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著增加,在一些CMDI和組織學(xué)評(píng)分較高的大鼠,還可見TLR2表達(dá)于腸上皮近腸腔側(cè)胞膜,TLR4表達(dá)于腸上皮近腸腔側(cè)胞膜和腺上皮近腺腔側(cè)胞膜(見表4、圖1)。五、mrna的表達(dá)TLR2、TLR4、TLR9mRNA在正常對(duì)照組結(jié)腸組織中均未見表達(dá),模型組可見三者mRNA表達(dá),相對(duì)表達(dá)量分別為1.99±0.34、2.10±0.38和1.30±0.25(見圖2),均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。六、tlr2表達(dá)對(duì)模型組和正常對(duì)照組各指標(biāo)行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果顯示TLR2、TLR4、TLR9三者之間互呈正相關(guān)。TLR2的表達(dá)與CMDI、組織學(xué)評(píng)分、SOD活性和MPO活性有相關(guān)性;TLR4、TLR9的表達(dá)與DAI、CMDI、組織學(xué)評(píng)分、SOD活性和MPO活性有相關(guān)性。三者與CMDI、組織學(xué)評(píng)分和MPO活性呈正相關(guān),與SOD活性呈負(fù)相關(guān)(見表5)。免疫組化檢測(cè)IBD是一類非特異性炎性腸疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不明確,動(dòng)物模型的應(yīng)用對(duì)于研究其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。TNBS+乙醇誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型目前廣泛應(yīng)用于IBD的實(shí)驗(yàn)研究。TNBS是一種半抗原,以乙醇損傷腸黏膜屏障可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)TNBS的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以TNBS+乙醇誘導(dǎo)的大鼠模型除有體質(zhì)量減輕、腹瀉、便血等臨床癥狀外,還可見結(jié)腸組織充血、水腫、糜爛、出血、潰瘍、大量炎性細(xì)胞浸潤等組織病理學(xué)改變,DAI、CMDI和組織學(xué)評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組,表明造模成功。TLRs的發(fā)現(xiàn)為研究免疫性疾病帶來了新的契機(jī)。在哺乳動(dòng)物對(duì)脂多糖(LPS)的反應(yīng)中,TLR4可能是LPS更主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,而TLR2可能參與其他病原體的識(shí)別,尤其是識(shí)別革蘭陽性細(xì)菌和酵母菌受體;TLR9則參與對(duì)細(xì)菌DNACpG的介導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)IBD時(shí)NF-κB表達(dá)升高,炎癥介質(zhì)過量表達(dá),提示TLRs家族可能在IBD的發(fā)病機(jī)制中起有重要作用。正常人對(duì)腸道菌群耐受,而IBD患者則可能存在耐受缺失。本研究發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組結(jié)腸黏膜下層和固有層炎性細(xì)胞僅有少量TLR2、TLR4表達(dá),而腸上皮則基本未見兩者表達(dá),推測(cè)與腸道的自身免疫耐受有關(guān)。模型組黏膜下層和固有層TLR2、TLR4的表達(dá)均顯著增加,與國外報(bào)道一致,這可能會(huì)增強(qiáng)炎性細(xì)胞對(duì)LPS以及其他抗原的識(shí)別和呈遞,使正常菌群被識(shí)別,從而打破自身免疫耐受,如免疫反應(yīng)過強(qiáng),可能造成腸道損傷。模型組一些CMDI和組織學(xué)評(píng)分較高的大鼠腸上皮也有TLR2、TLR4表達(dá),甚至腺上皮也有TLR4表達(dá),提示TLR2、TLR4表達(dá)越廣泛、越強(qiáng),腸道損傷越重。本研究還發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組結(jié)腸組織不表達(dá)TLR9,但模型組TLR9的表達(dá)顯著增加,這可能會(huì)增強(qiáng)炎性細(xì)胞對(duì)腸道菌群CpG的識(shí)別,從而造成腸道損傷。SOD在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中起重要作用,SOD活力與炎癥和自身免疫性疾病有密切關(guān)聯(lián),而MPO對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬等功能具有重要作用,組織MPO活性能反映中性粒細(xì)胞的浸潤程度,兩者均是評(píng)估腸道炎癥的常用指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)分析顯示TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)與MPO、SOD以及CMDI、組織學(xué)評(píng)分有良好的相關(guān)性,進(jìn)一步證實(shí)了三者與腸道損傷的對(duì)應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中正常對(duì)照組RT-PCR未能擴(kuò)增出明顯的TLR2、TLR4條帶,而免疫組化方法卻見兩者有少量表達(dá)?？赡?/p>