GB-T畜禽基因組編輯育種技術(shù)規(guī)程征求意見稿

ICS07.080

A20/39

中華人民共和國國家標準

GB/T╳╳╳╳-201╳

畜禽基因組編輯育種技術(shù)規(guī)程

Codeofpracticeforgenomeeditingbreedinginlivestockandpoultry

（征求意見稿）

201×-××-××發(fā)布201×-××-××實施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

GB/T╳╳╳╳-201╳

GB/T╳╳╳╳-201╳

畜禽基因組編輯育種技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了畜禽基因組編輯育種的技術(shù)要求。

本標準適用于畜禽基因組編輯育種的CRISPR/Cas技術(shù)操作規(guī)程。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適

用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T19489實驗室生物安全通用要求

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

基因組編輯genomeediting

基因組編輯指能夠?qū)δ繕嘶蜻M行特定DNA片段的敲除、突變和插入等操作的技術(shù)。

3.2

CRISPR/Casclusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins

常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)。

3.3

gRNAguideRNA

真核生物中參與RNA編輯的具有與目標RNA互補序列的RNA。

3.4

PAMprotospaceradjacentmotif

前間隔序列鄰近基序。位于靶DNA的3'末端短的DNA序列，參與CRISPR/Cas系統(tǒng)與靶位點

GB/T╳╳╳╳-201╳

的識別。

4要求

4.1設(shè)施和設(shè)備

實驗室設(shè)施和設(shè)備符合GB1948相應(yīng)的生物安全等級的要求。動物試驗場所符合GB19489

相應(yīng)的生物安全等級的要求。

4.2人員

應(yīng)通過必要的實驗技術(shù)和生物安全管理規(guī)范的培訓(xùn)。

4.3記錄

應(yīng)包括但不限于試驗開始和結(jié)束的時間，受試材料名稱、來源、編號、保存信息，目標基

因序列信息，載體結(jié)構(gòu)，測試圖譜和結(jié)果判定等。

4.4動物福利

應(yīng)經(jīng)過相關(guān)動物福利委員會的批準。

4.5其他

基因編輯育種的過程應(yīng)符合相應(yīng)法律法規(guī)的規(guī)定。

5基因編輯育種技術(shù)流程

技術(shù)流程見圖1：

GB/T╳╳╳╳-201╳

圖-1基因編輯育種技術(shù)流程圖

6操作步驟

6.1目標基因靶位點設(shè)計

比對全基因組序列，根據(jù)宿主基因的來源和載體啟動子的種類選擇適合的軟件設(shè)計宿主基

因上的靶位點。

注：PAM位點前20bp左右為gRNA靶序列引Cas9蛋白作用于基因組。在全基因組范圍內(nèi)比對序列同源性，

避開SNP突變位點和保守性較差的區(qū)域，盡量選擇那些在17bp~20bp匹配數(shù)量少的靶點以降低sgRNA靶向其他

位置的幾率。

6.2打靶載體的構(gòu)建

對基因成熟蛋白編碼區(qū)進行靶位點預(yù)測，設(shè)計相應(yīng)引物。根據(jù)基因編輯的方式和對象選擇

適宜的載體，進行連接、轉(zhuǎn)化和鑒定。應(yīng)對sgRNA的活性和脫靶效應(yīng)進行預(yù)測和驗證。

6.3細胞制備和轉(zhuǎn)染

6.3.1細胞制備

選擇適宜的培養(yǎng)條件培養(yǎng)細胞。選取生長良好的細胞，根據(jù)細胞類型選擇適宜的轉(zhuǎn)染方法

進行下一步轉(zhuǎn)染及突變效率的檢測。

6.3.2細胞的轉(zhuǎn)染

GB/T╳╳╳╳-201╳

細胞轉(zhuǎn)染采用電轉(zhuǎn)染或適宜的細胞轉(zhuǎn)染試劑盒。轉(zhuǎn)染后的細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染結(jié)

束后，按照動物細胞/組織提取試劑盒方法提取轉(zhuǎn)染細胞基因組DNA。

6.4突變細胞株的篩選和鑒定

6.4.1引物的設(shè)計及PCR產(chǎn)物的擴增

根據(jù)目標基因序列以及確定的靶點位置，利用專業(yè)軟件設(shè)計檢測引物。以提取的細胞全基

因組為模版，PCR擴增出目的片段。

6.4.2單克隆細胞制備

單克隆細胞可以按照有限稀釋法進行制備。參考標準按照每lOmL培養(yǎng)液中含有400個~500

個細胞進行稀釋，分裝到15個100mm細胞培養(yǎng)皿，在37℃、5％C02、飽和濕度條件下的二氧化

碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時更換培養(yǎng)液液并觀察細胞的大小及生長狀態(tài)。

6.4.3突變細胞株的鑒定和篩選

當(dāng)細胞培養(yǎng)皿中細胞克隆直徑生長至2mm以上時，用記號筆將單克隆細胞系圈上做標記，

取出細胞培養(yǎng)皿鑒定篩選陽性細胞克隆。刮取1/2的細胞克隆提取基因組進行PCR擴增，PCR產(chǎn)

物純化后鑒定。將突變的PCR產(chǎn)物純化與克隆載體連接，進行測序鑒定。

鑒定正確的細胞克隆，消化、收集突變細胞將其凍存用于后續(xù)研究。

選擇適宜方法檢測基因編輯效率，通過測序驗證編輯正確性，根據(jù)靶位點特性對脫靶以及

移碼突變進行預(yù)測和分析。

6.5基因編輯動物制備和鑒定

通過體細胞核移植技術(shù)或者線性化打靶載體原核注射-胚胎移植技術(shù)獲得初代基因編輯動物。

提取初代動物的基因組DNA，進行檢測引物PCR，PCR產(chǎn)物初步酶切鑒定，然后測序鑒定突變

類型。鑒定引物用細胞鑒定引物，鑒定體系如同細胞鑒定體系。

6.6擴繁

基因編輯群體通過分子