α-淀粉酶菌株搖瓶發(fā)酵初篩、復(fù)篩及酶活力測(cè)定

α-淀粉酶菌株搖瓶發(fā)酵初篩、復(fù)篩及酶活力測(cè)定

目的要求了解利用微生物搖瓶發(fā)酵初篩、復(fù)篩的目的及要求，其基本原理及方法。了解搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的原理、要求和方法技術(shù)。了解液體搖瓶發(fā)酵用培養(yǎng)基的配制要求。進(jìn)一步熟悉掌握碘比色法（部頒標(biāo)準(zhǔn)）測(cè)定α-淀粉酶活力的原理和方法步驟。基本原理?yè)u瓶培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)是在抗生素生產(chǎn)的需求條件下發(fā)展而來(lái)的——需求增加，規(guī)模擴(kuò)大，產(chǎn)量增加，調(diào)控控制。淺層培養(yǎng)發(fā)酵→深層培養(yǎng)發(fā)酵（實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)生產(chǎn)）根據(jù)用途配制含有適合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的液體培養(yǎng)基細(xì)胞懸浮于相應(yīng)液體培養(yǎng)基質(zhì)中，通過(guò)振蕩，細(xì)胞得到充分溶解氧，接觸較為新鮮的均勻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞代謝活性較高。發(fā)酵培養(yǎng)基（8瓶/組）

（100mL裝于500mL三角瓶）玉米淀粉（可溶性淀粉）1g；豆粕粉3g；Na2HPO4.12H2O0.8g；（NH4）2SO4

0.4g；NH4Cl0.15g；CaCO30.10g水100mL121.3℃滅菌20分鐘初篩和復(fù)篩所需要的一起準(zhǔn)備配制。發(fā)酵培養(yǎng)基配制說(shuō)明三角瓶規(guī)格要統(tǒng)一。先將不溶解的淀粉、豆粕粉、CaCO3分別稱于500mL三角瓶。將無(wú)機(jī)鹽稱量后先溶解于水中（在1000mL三角瓶中配制1000mL），調(diào)節(jié)pH為7.0~7.5，再用量筒量取100mL分別加于500mL三角瓶中，輕搖混勻。121.3℃滅菌20分鐘滅完菌后取出，要馬上輕搖混勻（？）。種子培養(yǎng)基

（復(fù)篩和正交試驗(yàn)使用）玉米淀粉（可溶性淀粉）10g；Na2HPO4.12H2O8g；（NH4）2SO4

4g；NH4Cl1.5g；3%豆粕粉浸出液1000mL煮沸使淀粉溶解后，取50mL分裝于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分裝于18×180mm試管中（7支），加塞包扎（本學(xué)期不使用，不需準(zhǔn)備）。121.3℃滅菌20分鐘液體接種用種子菌液制備劃線接種斜面，30℃培養(yǎng)7天以上備用（充分產(chǎn)芽孢）。復(fù)篩試驗(yàn)用：

挑取斜面菌種2環(huán)，洗滌于10mL無(wú)菌水中，制成菌懸液備用接種，接種前制備。正交試驗(yàn)用：30mL無(wú)菌水洗滌斜面（1支），制成菌懸液備用接種，接種前制備。其它器材1mL無(wú)菌吸管10支（本學(xué)期不需要準(zhǔn)備）2mL無(wú)菌吸管4支。分別標(biāo)記清楚。10mL無(wú)菌水1支，裝于18×180mm試管（全班統(tǒng)一包扎滅菌）。30mL無(wú)菌水2瓶裝于250mL三角瓶中，包扎，121.3℃滅菌20分鐘備用。搖瓶發(fā)酵初篩方法及步驟發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻后，利用接種環(huán)接種一環(huán)上周培養(yǎng)好的斜面菌種（1瓶/株）。37℃搖瓶培養(yǎng)（往復(fù)式，110轉(zhuǎn)/分鐘）3天。3天后小漏斗加少許脫脂棉花過(guò)濾發(fā)酵液。測(cè)定發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活力單位（碘比色法）——先測(cè)原發(fā)酵液、低于5min的稀釋后重測(cè)（2、5、10倍，控制終點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間為5-10min）。根據(jù)結(jié)果選出1~2株進(jìn)行下周的復(fù)篩試驗(yàn)。初篩接種培養(yǎng)時(shí)間星期二下午班次：星期二（3月19日）16：00~16：30；星期四上午班次：星期四（3月21日）11：00~11：30星期四下午班次：星期四（3月21日）16：00~16：30初篩和復(fù)篩試驗(yàn)接種培養(yǎng)測(cè)定時(shí)間安排班次初篩接種時(shí)間初篩測(cè)定時(shí)間復(fù)篩菌種活化接種時(shí)間復(fù)篩接種時(shí)間復(fù)篩測(cè)定時(shí)間星期二下午星期二16:00星期五8:30星期五10:30下周星期二14:00下周星期五8:30星期四上午星期四11:00星期六8:30星期六10:30下周星期四8:30下周星期六8:30星期四下午星期四16:00星期六10:30星期六12:00下周星期四10:30下周星期六10:30下周斜面接種于液體三角瓶的步驟和要求具體步驟先將接種環(huán)制好（直、環(huán)平、環(huán)稍小——直徑小于φ3mm）；挑取斜面菌種滿環(huán)（要求各瓶盡量一致，以第一瓶作為標(biāo)準(zhǔn)）；無(wú)菌操作取下三角瓶瓶布（連同包扎報(bào)紙，拿于手中），將接種環(huán)上的菌種涮洗于液體培養(yǎng)基中（液體培養(yǎng)基中摩擦瓶壁）；蓋瓶布（不要包扎報(bào)紙），捆扎好；放在搖瓶機(jī)上（注意不要損壞三角瓶），120轉(zhuǎn)/分，37℃往復(fù)振蕩培養(yǎng)2~3天。發(fā)酵液處理發(fā)酵液漏斗加棉花過(guò)濾；發(fā)酵液稀釋10倍；測(cè)定-酶淀粉酶活力單位；需要2%淀粉溶液3升/25組（20×4×25=2000mL），pH6.0緩沖液1升/25組（5×4×25=500mL）初篩使用挑取的斜面菌種直接接種（1瓶/株），37℃，往復(fù)搖瓶機(jī)110-120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)2-3天，斜面菌種繼續(xù)保藏；復(fù)篩使用的是初篩酶活力最大的菌株，先液體培養(yǎng)基活化18~24小時(shí)（37℃，旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)100-150轉(zhuǎn)/分鐘），接種量2mL/瓶（3-4瓶/株）

，37℃，往復(fù)式搖瓶機(jī)110-120/分鐘，培養(yǎng)3天；同時(shí)進(jìn)行斜面直接接種對(duì)照培養(yǎng)（條件同上）。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)的菌種活化

（？）復(fù)篩菌種活化培養(yǎng)時(shí)間要求：上課前一天中午12：45~13：30，斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基（50mL），37℃搖瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間：18~24小時(shí)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)的安排和步驟當(dāng)天上課時(shí)間制備發(fā)酵培養(yǎng)基（也可以初篩時(shí)一起準(zhǔn)備），3~5瓶/株菌（100mL/瓶），滅菌。將搖瓶培養(yǎng)好的菌種，用2mL無(wú)菌吸管吸取2mL接種于100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝于500mL三角瓶），37℃搖瓶培養(yǎng)（往復(fù)式110轉(zhuǎn)/分鐘）3天。3天后小漏斗脫脂棉花過(guò)濾發(fā)酵液。測(cè)定發(fā)酵液中α-淀粉酶酶活力單位（碘比色法）。根據(jù)結(jié)果可以判斷所選菌株產(chǎn)酶能力是否穩(wěn)定。本次實(shí)驗(yàn)基本流程準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌冷卻后接種環(huán)接種（1瓶/株）恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)發(fā)酵液棉花過(guò)濾測(cè)定酶活力確定1-2株復(fù)發(fā)酵菌株滅菌一級(jí)液體活化菌種液體菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（3-5瓶/株）準(zhǔn)備發(fā)酵培養(yǎng)基恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)發(fā)酵液棉花過(guò)濾測(cè)定酶活力思考題根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果，體會(huì)初篩和復(fù)篩的意義所在？根據(jù)已完成的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果及所存在的問(wèn)題？實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵的一些問(wèn)題介紹對(duì)微生物酶發(fā)酵研究中的一些問(wèn)題進(jìn)行討論標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的問(wèn)題（配制所需測(cè)定物質(zhì)的梯度濃度）酶的誘導(dǎo)問(wèn)題（微生物長(zhǎng)期適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果）酶發(fā)酵中氮源問(wèn)題（蛋白質(zhì)合成的一些問(wèn)題）酶的合成中能量問(wèn)題（需要消耗大量的能量）搖瓶發(fā)酵中的容量問(wèn)題（三角瓶，250、500ml）發(fā)酵中的溶解氧問(wèn)題緩沖液的配制問(wèn)題在α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基中CaCl2的使用問(wèn)題在搖瓶發(fā)酵中非可溶性物質(zhì)的加入問(wèn)題化學(xué)分析中基準(zhǔn)物的處理（純度、結(jié)晶水的處理——不穩(wěn)定）相關(guān)概念的介紹復(fù)壯——狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和測(cè)定典型性狀、生長(zhǎng)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚在未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施；而廣義的復(fù)壯則應(yīng)是一項(xiàng)積極的措施，即在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個(gè)體。相關(guān)概念的介紹菌種活化——使保藏的菌種（休眠狀態(tài)）恢復(fù)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)（包括一些菌種性能的恢復(fù)），生長(zhǎng)狀態(tài)的均一化（相對(duì)）。一般包括：斜面活化（平板劃線形成單菌落）；液體搖瓶培養(yǎng)；種子培養(yǎng)（針對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)）。相關(guān)概念的介紹種子培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)豐富，一般無(wú)限制性生長(zhǎng)因子，有利于菌體的增殖，生長(zhǎng)好；發(fā)酵培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成分有利于積累所需代謝產(chǎn)物，一般在培養(yǎng)基有一些限制性因子（包括培養(yǎng)條件）。注意：種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，注意微生物生長(zhǎng)延滯期（有一定營(yíng)養(yǎng)成分重疊）。實(shí)驗(yàn)室搖瓶機(jī)（搖床）的作用使培養(yǎng)基一直保持均勻狀態(tài)——菌體始終接觸到新的營(yíng)養(yǎng)成分（相對(duì)來(lái)說(shuō)）；快速稀釋代謝廢物（一般對(duì)細(xì)胞有毒害作用，對(duì)人類來(lái)說(shuō)可能有用）增加培養(yǎng)基中溶解氧的濃度，提高菌種的有氧代謝強(qiáng)度，加快物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有利于代謝產(chǎn)物的合成和積累。搖瓶機(jī)的種類旋轉(zhuǎn)式——轉(zhuǎn)速相應(yīng)較高（200轉(zhuǎn)以上），培養(yǎng)液貼壁旋轉(zhuǎn)；往復(fù)式——轉(zhuǎn)速不易太高，一般120轉(zhuǎn)/分左右，培養(yǎng)液來(lái)回振蕩，振蕩液面較高；往復(fù)式的溶氧效果較好（相對(duì)旋轉(zhuǎn)式）；注意搖瓶機(jī)的振幅（偏心距）。搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)三角瓶裝量的要求一般要求裝液量為三角瓶標(biāo)注容量的1/10~1/5如500ml三角瓶經(jīng)常加入50~100ml（常裝50ml或100ml）；如250ml三角瓶經(jīng)常加入25~50ml（常裝50ml）；注意：根據(jù)需要可以特制（如加擋板，增加溶解氧）。菌種斜面菌種活化（18~24hr）液體搖瓶活化（18~24hr）接種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)（2%，48~72hr）液體菌種活化培養(yǎng)基

（種子培養(yǎng)基）可以利用微生物實(shí)驗(yàn)書的淀粉培養(yǎng)基，注意調(diào)節(jié)pH值；也可以利用發(fā)酵培養(yǎng)基（豆粕粉需要煮水后使用）。培養(yǎng)接種需發(fā)酵測(cè)定的菌種活化培養(yǎng)液，1mL/瓶（接種量2-5%，實(shí)驗(yàn)前后統(tǒng)一）。37℃，搖瓶振蕩培養(yǎng)2-3天。實(shí)驗(yàn)α-淀粉酶活力測(cè)定方法介紹酶活力測(cè)定的方法碘比色法（有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）在一定反應(yīng)條件下，1小時(shí)轉(zhuǎn)化1g淀粉變?yōu)楹拿噶慷x為1個(gè)酶活力單位3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）在一定反應(yīng)條件下，1分鐘反應(yīng)生成1mg麥芽糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位注意：去除β-淀粉酶的干擾醫(yī)學(xué)上的一些測(cè)定方法（專用試劑盒，通過(guò)生化儀器反應(yīng)測(cè)定，需要微量快速）α-淀粉酶酶活力測(cè)定的原理底物（反應(yīng)物）為淀粉產(chǎn)物為麥芽糖、糊精等酶活力測(cè)定（碘比色法——目視）酶活力定義：在60℃下1小時(shí)內(nèi)將1克淀粉轉(zhuǎn)化為糊精的酶量稱一個(gè)酶活力單位（5~10分鐘反應(yīng)完成）。淀粉及糊精檢測(cè)原理：碘檢測(cè)淀粉（紫藍(lán)色，30分子以上）→紅色糊精（紅棕色，7-30分子）→無(wú)色糊精，7分子以下）→麥芽糖（不顯色）→葡萄糖（不顯色）計(jì)算公式：

酶活力測(cè)定步驟發(fā)酵液（酶液）2%淀粉液20mL+5mLpH6.0緩沖液預(yù)熱5min（60℃）預(yù)熱5min（60℃）吸取0.5mL混勻、計(jì)時(shí)（保溫60℃），反應(yīng)開(kāi)始在白瓷板上定時(shí)取樣（1滴）比色比色終點(diǎn)，計(jì)下反應(yīng)時(shí)間（與標(biāo)準(zhǔn)比色管顏色相同）代入公式計(jì)算酶活力單位1mL標(biāo)準(zhǔn)糊精液＋3mL標(biāo)準(zhǔn)稀碘液混勻標(biāo)準(zhǔn)比色管（紅棕色）對(duì)照比色確定反應(yīng)終點(diǎn)2min后未見(jiàn)明顯變色（繼續(xù)取樣比色），但可以進(jìn)行下一組測(cè)試。30min后未見(jiàn)明顯變色，可以終止測(cè)試（結(jié)果意義不大）。所選菌株產(chǎn)α-淀粉酶搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)的安排（液體二級(jí)活化）上課前一天下午17：00~17：30將斜面菌種接種一環(huán)于5mL種子培養(yǎng)基中（裝于18×180mL），37℃搖瓶培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)式150轉(zhuǎn)/分鐘）14~16hr。上課當(dāng)天上午8：00~8：30將上述搖瓶培養(yǎng)好的菌種，用1mL無(wú)菌吸管吸取1mL接種于30mL種子培養(yǎng)基中（裝于250mL三角瓶），37℃搖瓶培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)式150轉(zhuǎn)/分鐘）8~10hr。初篩菌株α-淀粉酶活力計(jì)算記錄表初篩菌株α-淀粉酶活力計(jì)算記錄表班次：組號(hào)：姓名：菌株編號(hào)反應(yīng)時(shí)間稀釋倍數(shù)