【黃瓜枯萎病生防細菌的篩選實驗探究報告6700字（論文）】

黃瓜枯萎病生防細菌的篩選實驗研究報告摘要近年來，由于生防菌防治枯萎病清潔高效，易于人工控制，并且相比于嫁接、施用農(nóng)藥等物理化學(xué)方法成本低，持效期長，因此，利用生物學(xué)方法防治黃瓜枯萎病逐漸走進人們的視野。本研究為了篩選出對黃瓜枯萎病具有防治效果的拮抗細菌，從黃瓜和辣椒根圍土壤采樣，并對樣本進行細菌分離得到了183株細菌，其中42株具有產(chǎn)纖維素酶活性，16株具有產(chǎn)嗜鐵素活性。通過平板拮抗實驗發(fā)現(xiàn)，5株細菌具有抑制枯萎病生長的作用。在該5株拮抗細菌中，2株同時具有上述酶活性，2株均不具備上述酶活性，1株只具有產(chǎn)嗜鐵素活性，且5株細菌拮抗病原菌活力大小與產(chǎn)酶活性之間無相關(guān)性。因此，針對特定病原菌，生防菌株的篩選還需要考慮更多可能存在的影響因素，以提高篩選效率。關(guān)鍵詞：黃瓜枯萎??；拮抗細菌；纖維素酶；嗜鐵素目錄TOC\o"1-3"\h\u1緒論 12材料與方法 42-1材料 42.-1-1樣品的來源 42-1-1培養(yǎng)基的配制 42-2菌種分離 42-2-1土壤樣品處理 42-2-2菌種分離 42-3測定項目與方法 52-3-1酶活性的檢測 52-3-2平板拮抗真菌活性篩選 53結(jié)果與分析 63-1嗜鐵素和 63-2平板拮抗真菌活性 8參考文獻 91緒論隨著人口的快速增長，經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人們對于食品的需求也不斷加大，對食材品質(zhì)要求也是同樣水漲船高。其中，黃瓜作為一種富含大量維生素，同時口感清脆，口味清爽的蔬菜，成為了經(jīng)常出現(xiàn)在餐桌上的角色。我國耕地面積世界排名第三，目前全世界黃瓜總栽培面積達到146.67萬hm2，其中我國栽培面積達到33.33萬hm2以上，達到世界產(chǎn)量的五分之一，因此對于黃瓜種植也同時需要加大重視[1]。黃瓜的種植生產(chǎn)需要光照充足，空氣流通的生長環(huán)境，如果操作不得當(dāng)，導(dǎo)致空氣不流通，濕度較大的話，很有可能會產(chǎn)生各種各樣的病蟲害。黃瓜苗期和成熟期會出現(xiàn)的病蟲害比較多，大致可以分為以下四類：真菌性病害，細菌性病害，生理性病害以及病毒性病害[2]。其中枯萎病對于黃瓜種植生產(chǎn)威脅最大。黃瓜枯萎病，又稱萎蔫病，蔓割病，死秧病，是一種典型的土壤傳染，通過根部或者頸部進入黃瓜組織，寄生在維管束內(nèi)大量繁殖，堵塞導(dǎo)管的系統(tǒng)性疾病[3]，其發(fā)病率一般為10-20%，嚴重的可達到50%以上。因為該病害由半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌引起，主要存在方式為寄生，所以黃瓜枯萎病屬于真菌性疾病。尖孢鐮刀菌并不只單單侵染黃瓜植株，它有五個常見的?；停狐S瓜、西瓜、甜瓜、絲瓜以及葫蘆。其中，黃瓜專化型專門在成熟期和苗期侵染黃瓜植株[4,5]。隨著栽培面積的不斷擴大，尤其是現(xiàn)在很多栽培選擇在大棚中進行，空氣不流通，陽光不充足，加上潮濕悶熱的環(huán)境，就給了枯萎病真菌良好的生長環(huán)境，導(dǎo)致枯萎病的發(fā)病率不斷上升。如果黃瓜種植期間染上了枯萎病，同時又沒有受到正確的處理的話，一般會造成20-30%的減產(chǎn)，如果染病情況嚴重，有可能會絕收[6]。因此探索出高效清潔同時又不會對黃瓜產(chǎn)量產(chǎn)生過于嚴重影響的防治措施便成為了黃瓜培養(yǎng)過程中重要環(huán)節(jié)[7]。對于防治黃瓜枯萎病，有各種各樣的方案，總體可分為物理防治方法，化學(xué)防治方法以及生物防治方法三大類。其中，預(yù)防枯萎病而采取的物理治理方法并不多，常見的主要有輪作和嫁接兩個方式。輪作，顧名思義，就是種完一輪黃瓜之后，再種植非瓜類作物，然后下一期再種植黃瓜，然后循環(huán)下去。因為不同的植物其生理性質(zhì)結(jié)構(gòu)一般不相同，不適用于枯萎病菌的寄生，這對于病原菌的生長繁殖可以起到很大程度的抑制作用[3]。另一種物理防治方法就是嫁接。一般會將南瓜作為砧木，以優(yōu)良黃瓜品種作為接穗培養(yǎng)，不讓黃瓜扎根于有病菌侵害的土壤，預(yù)防枯萎病的發(fā)生。以上兩種防治方法中，用輪作方式來抑制枯萎病菌生長的做法一般發(fā)病率較低，但是操作成本較大，同時也會導(dǎo)致作物收成不穩(wěn)定。然而用嫁接的方式抑制發(fā)病的方式可以杜絕黃瓜作物苗期感染枯萎病，但是因為黃瓜會產(chǎn)生不定根，如果栽培偏深而把接種處理在土壤中，或者整架落蔓時莖蔓著地接觸土壤，往往因為嫁接處產(chǎn)生不定根扎入土壤中失去嫁接防病的意義[8]。所以物理防治存在著防治方式較單一，預(yù)防效果受影響因素較多，同時對于作物的經(jīng)濟效應(yīng)也會產(chǎn)生很大影響的弊端。關(guān)于化學(xué)防治方法，大部分農(nóng)田里還是通過施放農(nóng)藥來達到預(yù)防或者抑制枯萎病的目的。目前使用的農(nóng)藥有速克靈，農(nóng)用鏈霉素[9]，多菌靈等。但是，因為這些農(nóng)藥殺菌劑，容易造成殘留，而且長時間使用會使病原菌產(chǎn)生耐藥性，造成防治效果逐漸降低，同時農(nóng)藥產(chǎn)生的殘留會被人們吸收進入人體，造成各種疾病，并且由于枯萎病是土傳疾病，如果大面積實行土壤藥劑處理，操作難度太大，操作成本昂貴[10]，所以近年來，高效清潔的生物防治逐漸引起了人們的關(guān)注。生物防治，顧名思義，就是通過生物學(xué)的方法利用遺傳育種或者基因工程相結(jié)合的技術(shù)培育出新的抗病品種，或者接種拮抗菌，來達到預(yù)防黃瓜枯萎病的目的[11,12]。生物防治目前主要有用到一下兩種手段：1.誘導(dǎo)抗性；2.接種有益菌[13-15]。誘導(dǎo)抗性防治，就是利用被弱化的或者無致病性病原菌株接種到黃瓜幼苗上，誘導(dǎo)黃瓜對枯萎病菌產(chǎn)生抗性，從而培育出具有抗性的黃瓜品種[16]。該技術(shù)不僅可以應(yīng)用于黃瓜生產(chǎn)，對于其他能夠患上枯萎病的農(nóng)作物，例如甘薯，西瓜，番茄等，都有防治效果。在日本的甘薯產(chǎn)區(qū)，利用誘導(dǎo)抗性防治枯萎病的田間防效已達到83%-90%。雖然培育出來的品種具有良好的抗病性，但是這種培育方式存在著培育周期過長，并且隨著培育代數(shù)增加，防效還會逐漸下降的缺點。因此，現(xiàn)代生防技術(shù)更多的是使用接種有益菌的方式。當(dāng)下用來接種的有益菌大致可以分為兩種，細菌和真菌。真菌主要有木霉屬真菌，非致病尖孢鐮刀菌，從枝菌根真菌，淡紫擬青霉等[17]。其中木霉菌極易分離和培養(yǎng)，繁殖速度快，能迅速占領(lǐng)空間，競爭養(yǎng)分，對于多種病原真菌具有重寄生作用，同時又有很強的纖維素分解能力，對于枯萎病菌的抑制作用很強，被認為是極具價值的植病生防因子。但是木霉菌單獨培養(yǎng)時定殖能力不強，生長繁殖易受環(huán)境影響，導(dǎo)致其防治效果穩(wěn)定性不佳。非致病性尖孢鐮刀菌的防治機理主要為通過與病原菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)的方式對致病菌株的直接拮抗作用和通過寄主作用的間接拮抗作用[18]。叢枝菌根真菌廣泛分布于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，可以與大部分植物根系形成菌根，加強植物對土壤當(dāng)中營養(yǎng)成分的吸收，從而促進植物生長繁殖。相比于真菌，細菌在植物病蟲害的防治方面也具有十分突出的優(yōu)點：1.細菌種類繁多，生長繁殖速度驚人；2.許多細菌存在于植物的根部和地上部分，與植物的生理狀態(tài)相適宜；3.細菌大部分可以人工培養(yǎng)，容易控制，在生產(chǎn)操作中也較容易實現(xiàn)4.有些細菌在防治病害的同時還可以分泌有益因子增加作物的產(chǎn)量。其作用機理主要為與病原菌競爭生態(tài)位，競爭營養(yǎng)，產(chǎn)生抗菌因子等。由于黃瓜枯萎病病原菌為真菌，其細胞壁中含有纖維素，幾丁質(zhì)等物質(zhì)，因此接種可分泌纖維素酶的細菌可通過與病原菌競爭纖維素等生存資源的方式達到防治黃瓜枯萎病的效果?？僧a(chǎn)生嗜鐵素的細菌防治機理可以簡述為：鐵元素是微生物生長繁殖當(dāng)中必不可少的一種元素，病原菌大部分本身并不能或者很少產(chǎn)生嗜鐵素，只能通過寄生宿主，利用宿主的嗜鐵素吸收土壤中的鐵元素，用于自身的生長繁殖。而通過接種可以自身分泌嗜鐵素的細菌，可以讓細菌與病原菌競爭鐵元素，因為病原菌本身不能或很少分泌嗜鐵素，其產(chǎn)生的嗜鐵素也會被有益菌所利用，而生防菌產(chǎn)生的的嗜鐵素卻不能被病原菌利用，從而病原菌因為缺少鐵元素而無法生長繁殖[19]，由此達到防治病害的效果[15,20]。為了獲得能夠防治枯萎病菌的生防菌，需要用最優(yōu)化的方式篩選出最穩(wěn)定最合適細菌菌種[21]。目前篩選生防菌用到的主要手段是根據(jù)其代謝產(chǎn)物活性大小和與病原菌的拮抗作用強弱來篩選[22]。本次實驗擬通過目的性菌株初分離，結(jié)合菌株產(chǎn)生嗜鐵素活性和菌株的纖維素酶活性測定，以及對黃瓜枯萎病病原菌的平板拮抗活性，旨在篩選出能夠防治黃瓜枯萎病的生防菌株。2材料與方法2材料2-1-1樣品的來源土壤樣品：2016年9月在淮安丁集鎮(zhèn)的蔬菜大棚，隨機分別選取5處黃瓜和辣椒的根圍土壤，另外各取一份非根圍土壤做對照。供試真菌：枯萎病原菌（Fusariumoxysporum）。2-1-2培養(yǎng)基的配制2-1-2-1LB培養(yǎng)基：瓊脂15g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，定容至1000ml，pH7.2[4]。2-2-2-2KB培養(yǎng)基：蛋白胨20g，甘油10ml，硫酸鎂1.5g，磷酸氫二鉀1.5g，瓊脂15g，定容至1000mL，pH7.2。2-2-2-3纖維素酶活性測定培養(yǎng)基：蛋白胨10g，羧甲基纖維素鈉10g，酵母粉10g，磷酸二氫鉀1g，瓊脂18g，氯化鈉5g，定容至1000mL，pH7.0。2-2-2-4WA培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏3g葡萄糖10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，定容至1L，pH=6.8。2-2-2-5PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，定容至1000mL。2-2菌種分離2-2-1土壤樣品處理將滅菌的LB和KB培養(yǎng)基均勻的倒在培養(yǎng)皿上，待其變冷凝固后，將土壤樣品5g溶于45mL滅菌水中，搖勻后進行梯度稀釋至10-5。分別吸取10-3，10-4，10-5三個梯度100μL涂布在已凝固的培養(yǎng)皿上，做了5組平行樣品。做好標(biāo)記放入28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)下培養(yǎng)2天。培養(yǎng)完成后將平板取出，數(shù)菌落數(shù)并記錄。2-2-2菌種分離每種樣品各選一個有足夠合適菌群數(shù)的培養(yǎng)皿，用接種環(huán)從分離培養(yǎng)皿上蘸取菌種，以劃線的方式將其劃在相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿可以接三個菌種，劃線方式如下（圖1）所示。將接好的平板做好標(biāo)記在室溫下培養(yǎng)2天，利用滅菌牙簽挑取單菌落用液體培養(yǎng)基在28℃下擴大培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后吸取菌液和80%滅菌甘油按照1:1體積混合，然后采用-70℃低溫保存。通過初篩和復(fù)篩，最后篩選出183株細菌。圖1菌株平板劃線培養(yǎng)法2-3測定項目與方法2-3-1酶活性的檢測2-3-1-1纖維素酶活性的檢測：對篩選出的183株細菌參照GhoseT.K(1987)方法測定纖維素酶活性。把準(zhǔn)備好的菌株用滅菌牙簽接到纖維素酶活性測定玻璃板上(酵母粉10g，蛋白胨10g，羧甲基纖維素鈉10g，氯化鈉5g，瓊脂18g，磷酸二氫鉀1g，定容至1000mL，pH7.0)，30℃培養(yǎng)48h后，用1g/L的剛果紅染1h后，倒掉染液，用1M的氯化鈉浸泡1h。檢測是否有透明圈。2-3-1-2嗜鐵素活性檢測：用篩選出的183株細菌，參照Shinetal等人(2001)的方法測定嗜鐵素。A溶液：60.5mg鉻天青S溶于50ml去離子水10ml三價鐵溶液(1mML氯化鐵3.6H2O，10mL鹽酸為溶劑)和73mg十六烷基三甲基溴化銨溶于40ml去離子水溶液混合定容至100ml，pH調(diào)至中性，121℃滅菌20min。B溶液:900mlWA培養(yǎng)基，12g50%(W/V)的NaOH溶液將培養(yǎng)基pH調(diào)至6.8，121℃滅菌20min。A，B液混合倒平板，接菌，30℃培養(yǎng)3天進行觀察。2-3-2平板拮抗真菌活性篩選將病原真菌Fusariumoxysporum，在potato-dextroseagar（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在28℃恒溫培養(yǎng)一周后，菌落基本覆蓋培養(yǎng)皿。用打孔器取下菌塊，接種到LB培養(yǎng)皿上，將生長真菌的一面貼在容器的中間。使用滅菌的牙簽將細菌接入進行拮抗培養(yǎng)，細菌分布在真菌塊周圍大約2厘米處，每各細菌間留有一定的距離，一個一個培養(yǎng)皿接7到8個細菌菌種。所有菌種都要做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，注意培養(yǎng)皿必須倒置。3結(jié)果與分析3-1嗜鐵素和纖維素酶活性由表1可以看出，能夠產(chǎn)生嗜鐵素的細菌絕大部分來自于能夠在LB培養(yǎng)基上生存的細菌，只有一株細菌是可以在KB培養(yǎng)基上生存的；另外，10株是從辣椒根圍土壤和中分離得到，另外6株細菌是從黃瓜根圍土壤中分離得到。通過分析可知，由于KB培養(yǎng)基中所加入鐵元素的含量很低甚至沒有，所以通過分泌嗜鐵素來吸收鐵離子生長繁殖的細菌無法在KB培養(yǎng)基上生存，而LB培養(yǎng)基中因為加入了酵母浸粉，其中含有的微量元素給細菌提供了鐵離子，于是需要鐵離子來生長的細菌就可以正常存活，因此可分泌嗜鐵素的細菌才會絕大部分都是由LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的。另外，有學(xué)者研究得到[1,23]，由于黃瓜果實的生長過程中需要鐵元素的參與，而相比之下辣椒的果實生長過程當(dāng)中需要的鐵元素含量遠遠低于黃瓜，因此大部分需要鐵離子才能生長的細菌更容易在辣椒的根圍土壤中生存，避免辣椒爭奪鐵離子，所以相比之下在黃瓜根圍土壤當(dāng)中生存的較少。表1嗜鐵素活性篩選結(jié)果菌株編號菌株來源嗜鐵素活性（水解圈半徑）mm菌株編號菌株來源嗜鐵素活性（水解圈半徑）mmH2-12KH3-19LH3-1LH3-7LH3-8LHCK-8LL1-1LL1-3L黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜辣椒辣椒2.62.0L2-3LL3-3LL4-4LL4-6LL4-8LL5-10LL5-2LL5-4L辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒2.02.5表2表明，具有纖維素酶活性的42株細菌中，有31株細菌是來自于黃瓜根圍土壤，只有11株是來自于辣椒根圍土壤。另外，有26株都是在LB培養(yǎng)基上生長的，其余16株細菌是在KB培養(yǎng)基上生長。初步推測由于黃瓜生長過程中會產(chǎn)生很多的不定根以及藤蔓，這些藤蔓和不定根在黃瓜成熟時會隨著果實一起掉落，因此很多可以分解纖維素的細菌會利用這些掉落的藤蔓，分解其中的纖維素作為自身生長的營養(yǎng)；而相比較下，辣椒根圍土壤中的纖維素較少，所以其具有纖維素酶活性的細菌較少。表2纖維素酶活性篩選結(jié)果菌株編號菌株來源纖維素酶活性（水解圈半徑）mm菌株編號菌株來源纖維素酶活性（水解圈半徑）mm菌株編號菌株來源纖維素酶活性（水解圈半徑）mmH1-11KH1-6KH2-22KH2-23KH2-25KH2-29KH2-3KH3-11KH3-12KH3-16KH3-1KL1-1KL3-1KL3-2K黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜辣椒辣椒辣椒4.81.02.01.01.03.02.55.0L3-3KL5-1KH1-13LH1-16LH1-17LH1-18LH2-17LH2-1LH2-2LH2-9LH3-10LH3-18LH4-12LH4-2L辣椒辣椒黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜5.53.02.02.01.01.51.05.9H4-4LH4-9LHCK-14LHCK-15LHCK-16LHCK-17LHCK-18LHCK-1LL1-1LL1-2LL3-3LL4-5LL5-10LL5-3L黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜黃瓜辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒辣椒6.92.03.52.02.04.02.52.03.03.58.0AB圖2分離的細菌產(chǎn)纖維素酶和嗜鐵素活性(A、纖維素酶；B、嗜鐵素)3.2平板拮抗真菌活性表3平板拮抗真菌活性檢測結(jié)果菌株標(biāo)號F.oxysporum(抑菌圈半徑)mm菌株產(chǎn)纖維素酶活性（水解圈半徑）mm菌株產(chǎn)嗜鐵素活性（水解圈半徑）mmH4-7LL1-1LL1-3LL3-6LL5-10L4.03.03.06.04.0-6.5--3.5-5.03.0-2.0 圖3分離的細菌對枯萎病菌的拮抗活性從表3可以看出，5種細菌中，2種細菌具有產(chǎn)纖維素酶的活性，3種細菌具有產(chǎn)嗜鐵素的活性，且5種可拮抗病原菌的細菌都是從可在LB培養(yǎng)基生長的細菌當(dāng)中篩選得到。因此可以推測，有上述2種活性的細菌具有拮抗病原菌生長的可能。并且根據(jù)對比可知，拮抗作用的大小與細菌的嗜鐵素活性或纖維素酶活性并無相關(guān)性，只能看出只要存在這2種活性，就能一定程度上抑制病原菌的生長繁殖。表中還有2類細菌并不存在本實驗中測定的2種活性，但是仍然對病原菌產(chǎn)生的拮抗作用，推測可能是由于細菌與病原菌在其他營養(yǎng)物質(zhì)如碳源和氮源方面的競爭導(dǎo)致。3.3結(jié)論本實驗分離得到183株根圍細菌，其中42株具有產(chǎn)纖維素酶活性，16株具有產(chǎn)嗜鐵素活性。通過平板拮抗實驗發(fā)現(xiàn)，5株細菌具有抑制枯萎病生長的作用，在該5株拮抗細菌中，2株同時具有上述酶活性，2株均不具備上述酶活性，1株只具有產(chǎn)嗜鐵素活性，且5株細菌拮抗病原菌活力大小與產(chǎn)酶活性之間無對應(yīng)關(guān)系。因此，針對特定病原菌，生防菌株的篩選還需要考慮更多可能存在影響的因素，以提高篩選效率。參考文獻[1] 何曉明,林毓娥,陳清華,等.不同類型黃瓜的營養(yǎng)成分分析及初步評價[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,(04):15-17.[2] 文切木·艾爾肯.黃瓜種植過程中的常見病害及防治方法[J].南方農(nóng)業(yè),2016,10(21):60-61.[3] 羅文輝,黃忠明,吳運華.黃瓜枯萎病的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2007,(19):92-93.[4] 王亞娟,張顯,杜勝利.黃瓜枯萎病與抗性遺傳育種進展[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2005,14(5):168-172.[5] 許田芬.西瓜病蟲害的種類及生物學(xué)特性研究[D].蘇州大學(xué)農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治,2008.[6] 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