昆蟲表達(dá)系統(tǒng)PPT課件

基因表達(dá)與調(diào)控,真核表達(dá)_昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),1,真核表達(dá)系統(tǒng)的種類和常用載體,1.真核表達(dá)系統(tǒng)的種類酵母絲狀真菌昆蟲哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動物植物反應(yīng)器,2.真核表達(dá)載體質(zhì)粒：真核表達(dá)元件、真核抗性病毒載體：改建后SV40病毒腺病毒反轉(zhuǎn)錄病毒痘苗病毒,2,SV40病毒,SV40(Simianvacuolatingvirus40orSimianvirus40)是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的縮寫，多瘤病毒科，這是在人類和猴子都發(fā)現(xiàn)的致瘤病毒。SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，基因組5.2kb，病毒的直徑45nm，病毒成熟部位細(xì)胞核，無被膜，62個核殼粒亞單位，這種大小很適于基因操作。同時它也是第一個完成基因組DNA全序列分析的動物病毒。,3,以單純皰疹病毒為例。（1）病毒與細(xì)胞結(jié)合；（2）病毒進(jìn)入細(xì)胞，去包膜；（3）脫殼；（4）病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核；（5）病毒基因組復(fù)制，合成子代病毒及病毒mRNA；（6）以病毒基因轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；（7）病毒mRNA翻譯病毒子代蛋白，包括早期蛋白和晚期蛋白；（8）裝配子代病毒；（9）出核，同時披上包膜；（10）釋放到胞外,病毒復(fù)制（SV40示例）,4,病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點,病毒基因組大小相差較大,與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成，病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，噬菌體（細(xì)胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的，無內(nèi)含子基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子，病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位,形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，多順反子除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次,5,構(gòu)建真核表達(dá)系統(tǒng)_細(xì)胞必需表達(dá)元件,原核DNA序列啟動子增強子拼接信號終止子和多聚腺苷化信號篩選標(biāo)記動物病毒基因序列,6,病毒載體優(yōu)點,真核細(xì)胞可識別的啟動子報告基因感染周期，可持續(xù)復(fù)制部分載體可整合入基因組部分載體本身帶有完整的復(fù)制及表達(dá)元件部分載體具有宿主細(xì)胞特異性識別受體假病毒顆粒,桿狀病毒及其基因組模型,7,昆蟲桿狀表達(dá)系統(tǒng)簡介,桿狀病毒是已知昆蟲病毒中最大的類群,發(fā)現(xiàn)最早、研究最多且實用意義很大的昆蟲病毒。20世紀(jì)80年代以來由于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（baculovirusexpressionvectorsystem，BEVS）的建立,已被公認(rèn)為是當(dāng)今基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點,如多角體啟動子控制下的高效表達(dá),完善的轉(zhuǎn)譯后加工修飾,較易從無血清培養(yǎng)上清中純化的蛋白,無內(nèi)毒素污染等。桿狀病毒載體系統(tǒng)主要分為兩大類,一類是用于表達(dá)單個外源基因的載體,另一類是多元表達(dá)載體,用于插人并表達(dá)2個或多個外源基因,8,桿狀病毒_昆蟲表達(dá)系統(tǒng),桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb啟動子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強啟動子表達(dá)系統(tǒng)（兩種）桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染同源重組空斑篩選純化重組病毒,9,昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的分子基礎(chǔ),目前已知基因組全序列的桿狀病毒有苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)、家蠶核多角體病毒(BmNPV)、黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣殼核多角體病毒(LdMNPV)、甜菜夜蛾多核衣殼核多角體病毒(SeMNPV)、棉鈴蟲核型多角體病毒(HaNPV)以及斜紋夜蛾核型多角體病毒(SplMtNPV)桿狀病毒在其生活史中共有兩種形式的表型存在,在感染的初期(024h),主要以細(xì)胞釋放型病毒粒子(cell-releasedvirus,CRV)為主,也稱為胞外型病毒(extracellularvirus,ECV)或出芽型病毒(Buddedvirus,BV);在感染的晚期主要以包埋型病毒(occludedvirus,OV)的形式存在。桿狀病毒的這兩種表型的形態(tài)、蛋白組成、病毒囊膜的來源、感染組織特異性以及病毒入侵宿主細(xì)胞的方式都不相同。由于兩種表型的病毒在結(jié)構(gòu)組成上的差異,所以桿狀病毒在不同的時期需要表達(dá)不同類型的蛋白來滿足病毒顆粒不同形式的組裝。昆蟲桿狀病毒的基因表達(dá)共分為4個時期:極早期、早期、晚期、遲晚期。4個時期的基因一環(huán)扣一環(huán),按時間先后,以級聯(lián)方式嚴(yán)格制約。早期表達(dá)的基因有ie-1、me53、pe38、ie-2等,晚期表達(dá)的基因有vp39、vp80、polh、p10等,這些不同的基因所表達(dá)的蛋白各自具有不同的功能,有些表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)控的功能,而有些僅僅只具有結(jié)構(gòu)蛋白的作用。在桿狀病毒所表達(dá)的一系列蛋白中,有一類蛋白具有較高的表達(dá)量,并且均為病毒基因組復(fù)制所非必需,其中最具代表性的有多角體蛋白與P10蛋白,均屬于晚期表達(dá)的蛋白,受晚期啟動子的調(diào)控。昆蟲的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)正是利用了這類蛋白的優(yōu)點,從而提供了外源DNA插入座位。,10,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點,容量大：能插入12kb的外源基因高表達(dá)：采用的polh基因啟動子是目前所知的最強的真核啟動子；產(chǎn)物對宿主影響?。划a(chǎn)物可結(jié)晶高效：可同時表達(dá)多個基因安全：桿狀病毒對脊椎動物無病原性具加工修飾功能：昆蟲細(xì)胞屬較高等真核細(xì)胞家蠶表達(dá)系統(tǒng)中，家蠶易飼養(yǎng),11,表位標(biāo)記與構(gòu)建重組體注意事項,表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，一般由少至幾個氨基酸的多肽組成用于重組DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和）優(yōu)點用一種抗體可鑒別不同重組蛋白不影響蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：6His；FLAG；LZ等,使用常用密碼子注意克隆位點（限制性酶切位點）相符5端加上起始密碼子ATG3端加上終止密碼子可插入蛋白酶切位點基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意點,12,基因?qū)氲母鞣N方法,光穿孔法：激光；懸浮細(xì)胞沖擊波：活體局部的基因轉(zhuǎn)移基因槍法：即微粒轟擊；動物細(xì)胞，更適用于植物細(xì)胞穿孔法：脈沖電場；Cytomix緩沖液；70%細(xì)胞死亡時效率最高磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體法：Lipofectin；陽離子抗體轉(zhuǎn)染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉(zhuǎn)錄病毒感染法,13,表達(dá)產(chǎn)物的檢測技術(shù),Western印跡法免疫學(xué)方法抗原-抗體反應(yīng)熒光顯微鏡法表位標(biāo)記的抗體與直接抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記免疫學(xué)方法Western印跡法蛋白樣品制備SDS-PAGE（按分子量大?。╇娹D(zhuǎn)移一抗（特異性）二抗顯色敏感度：1-5ng,14,桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)路線,BEVS通常由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)三部分組成,其技術(shù)路線分以下幾步:先將外源片段克隆到載體質(zhì)粒中,置于桿狀病毒啟動子控制之下,上下游各有一段與親本病毒DNA相匹配的側(cè)翼序列,構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體;然后把轉(zhuǎn)移載體和野生型病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞,通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組,再以特定的篩選標(biāo)記和方法獲得重組病毒。由于病毒原來的非必需區(qū)段被外源片段取代,當(dāng)重組病毒在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時,外源片段也得到了表達(dá)。最后空斑純化重組病毒,擴大培養(yǎng),分離、純化所表達(dá)的外源蛋白。技術(shù)路線英文參考文獻(xiàn)：CHRISTOPHERDR.BaculovirusexpressionprotocolsM.Totowa:HumanaPressInc,1995:12-23.,15,重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建,16,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用,1，基礎(chǔ)研究如為功能基因組學(xué)研究提供種類繁多、數(shù)量龐大的蛋白2.開發(fā)醫(yī)用疫苗和藥物HIV疫苗的研究與開發(fā)，禽流感病毒疫苗生產(chǎn)；家蠶宿主BEVS生產(chǎn)重組多態(tài)藥物，或生產(chǎn)魚疫苗再用蠶蛹飼喂魚，改善魚類的食用品質(zhì)3.農(nóng)業(yè)生物殺蟲劑家蠶重組NPV（核多角體病毒）用作生物殺蟲劑的突出優(yōu)點是對人體安全，不傷害害蟲的天敵，不污染環(huán)境4.基因治療最近幾年來,桿狀病毒在小鼠和大鼠肝骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移中取得成功基因治療參考文獻(xiàn)：（小鼠和大鼠肝）HofmannC.,StraussM.Gene.Therapy,1998,5(4):531536.（小鼠骨骼?。㏄ieroniL.,MaioneD.,LaMonica.N.Hum.GeneTherapy,2001,12(8):871881.（小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)）SarkisC.,SergueraC.,PetresS.,BuchetD.,RidetJ.L.etal.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97(26):1463814643.,17,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的局限性,1.無法進(jìn)行連續(xù)性（高）表達(dá)2.糖基化方式與哺乳動物存在一定差異3.糖側(cè)鏈甘露糖的成分較高，而復(fù)合寡糖缺乏4.功能基因組學(xué)的研究仍然比較薄弱5.有關(guān)病毒晚期的高表達(dá)和調(diào)控機制等仍不夠明了6.酵母篩選系統(tǒng)比昆蟲細(xì)胞重組介質(zhì)相對更有優(yōu)勢，重組病毒與原病毒的混合增加篩選難度,18,桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的部分改進(jìn),1.用病毒早期啟動子與晚期啟動子以及嵌合與修飾啟動子，讓桿狀病毒系統(tǒng)持續(xù)表達(dá)2.通過親本病毒的線性化，非必需基因的缺失以增加外源基因表達(dá)途徑來大大提高重組病毒篩選效率與穩(wěn)定性3.桿狀病毒穿梭載體bacmid（Baculovirusplasmid，桿狀病毒質(zhì)粒）的構(gòu)建，可被修飾并在原核細(xì)胞與真核細(xì)胞之間穿梭表達(dá)。Bac-to-Bacsystem。這一方法利用了轉(zhuǎn)座酶將外源基因轉(zhuǎn)座到病毒基因組的特異性位點,重組后的病毒基因組現(xiàn)在被俗稱為Bacmid。在Bacmid中,外源基因被核多角體啟動子控制,并包含了不同的抗性基因及LacZ缺失標(biāo)記,極大地方便了重組病毒的篩選及鑒定。4.病毒滴度測定方法的改進(jìn)，傳統(tǒng)的病毒滴度