HILIC色譜柱介紹

1、.親水作用色譜（HILIC）是近年來(lái)色譜領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。本文簡(jiǎn)介了HILIC的起源、定義、分離特點(diǎn)；比較了HILIC和反相色譜（RPLC）的選擇特性，討論了HILIC與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的特點(diǎn)，并對(duì)其使用中的注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié)。1. HILIC的概念親水色譜（HILIC）是一種用來(lái)改善在反相色譜中保留較差的強(qiáng)極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)。它通過(guò)采用強(qiáng)極性固定性，并且結(jié)合高比例有機(jī)相/低比例水相組成的流動(dòng)相來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目的。而這樣的流動(dòng)相組成尤其有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）的靈敏度。2. HILIC的分離機(jī)制HILIC的分離機(jī)理在目前還存在著爭(zhēng)議，主要包括以下三個(gè)方面：（1）分配機(jī)理（2

2、）離子交換（3）偶極-偶極相互作用。更多的試驗(yàn)現(xiàn)象則表明HILIC的保留機(jī)理包含氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級(jí)效應(yīng)，很難將其區(qū)分開(kāi)來(lái)。3.HILIC影響保留的主要因素普遍認(rèn)為HILIC保留行為受到多種參數(shù)的影響，如固定相的官能團(tuán)、有機(jī)改性劑的含量、流速、柱溫、流動(dòng)相緩沖體系的pH值、緩沖鹽的種類(lèi)和濃度。影響樣品在固定相上的保留行為的最主要因素都是流動(dòng)相中有機(jī)相的比例，例如乙腈的含量的增加會(huì)顯著增加樣品的保留因子。在HILIC分離模式中，溶劑洗脫能力由弱到強(qiáng)為：四氫呋喃丙酮乙腈異丙醇乙醇甲醇水, 流動(dòng)相中水是最強(qiáng)的洗脫溶劑。一般采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相，其中水相的比例為5%-40%以保

3、證其顯著的親水作用。如圖1所示，將流動(dòng)相中的水相用甲醇、乙醇、異丙醇代替，隨著流動(dòng)相極性的減小，待測(cè)物在柱上的保留就會(huì)增強(qiáng)。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid.4. HILIC與RP-HPLC的比較傳統(tǒng)的反相色譜（RPLC）對(duì)強(qiáng)極性和親水性的小分子物質(zhì)的保留和分離

4、能力較弱，通常流動(dòng)相需要采用高比例的水相才能實(shí)現(xiàn)其保留，然而高比例的水相會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，比如固定相的反浸潤(rùn)和ESI-MS靈敏度的下降。HILIC正好可以解決這些問(wèn)題，它提供了一種與傳統(tǒng)RPLC互補(bǔ)的保留方式，能夠使在RPLC上保留較弱或沒(méi)有保留的物質(zhì)在HILIC柱上提供合適的保留，如圖2所示：Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm4.6 mm, 3-m dp Atlanti

5、s dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm4.6 mm, 3-m dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrilewater containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin.另外，HILIC柱上的洗脫順序與RPLC柱上的正好相反，極性較小的

6、物質(zhì)先出峰，極性較大的物質(zhì)后出峰。如圖3所示：Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm2.1 mm, 1.7m (A) ACQUITY UPLC BEH C18 (B) ACQUITY UPLC BEH HILIC. Peaks: 1 = acetylcholine, 2 = choline5.HILIC與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用 HILIC可

7、為強(qiáng)極性和強(qiáng)親水性的化合物提供合適的保留。通過(guò)優(yōu)化多個(gè)色譜參數(shù)，有利于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分和基質(zhì)中干擾物質(zhì)的分離，從而降低基質(zhì)效應(yīng)的影響；而含有高比例水溶性有機(jī)相的流動(dòng)相又有利于提高質(zhì)譜離子化效率，進(jìn)而提高質(zhì)譜分析的靈敏度。 質(zhì)譜響應(yīng)在某種程度上是取決于流動(dòng)相中有機(jī)相的比例。采用ESI源時(shí)，毛細(xì)管中離子化的過(guò)程類(lèi)似于一個(gè)電泳過(guò)程。由于毛細(xì)管被加高壓，形成帶電液滴。溶劑蒸發(fā)，離子向液滴表面移動(dòng)，當(dāng)液滴表面電荷產(chǎn)生的庫(kù)侖排斥力與液滴表面的張力大致相等時(shí)，液滴會(huì)分裂成更小的液滴，對(duì)于半徑10nm的液滴, 液滴表面形成的電場(chǎng)足夠強(qiáng)，電荷的排斥作用最終導(dǎo)致部分離子從液滴表面蒸發(fā)出來(lái)，形成了氣相離子。而有機(jī)相的表

8、面張力比水相的表面張力小得多。因此，在相同的條件下，流動(dòng)相中有機(jī)相的比例越高，質(zhì)譜的響應(yīng)越高。從圖4可以看出，在HILIC柱上的響應(yīng)比在RPLC柱上的響應(yīng)高出十倍左右。Figure 4. Chromatograms comparing the retention and MS response of analyte on C18 m Inertsil ODS-3; mobilemcolumn and HILIC column. (A) Column: 2.150mm, 3 phase: methanol-water containing 0.2% formic acid (15:85, v/v

9、) (B) Column: m ACQUITY UPLC BEH HILIC; mobile phase: methanol-water containingm2.150mm, 1.7 0.2% formic acid (85:15, v/v)6. HILIC柱的使用（1）初次使用HILIC柱時(shí)，應(yīng)采用50倍柱體積的乙腈-水（50:50）平衡，在進(jìn)第一針前，應(yīng)用初始流動(dòng)相平衡20倍的柱體積。（2）HILIC柱沖柱子時(shí)，采用的是乙腈-水（50:50）來(lái)洗去極性物質(zhì)。如果解決不了問(wèn)題，可以使用乙腈-水 (5:95) 來(lái)沖柱子。長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，將柱子保存在乙腈-水(95:5)中。（3）要保證流動(dòng)相中至

10、少40%的有機(jī)相。流動(dòng)相中使用添加劑時(shí)，醋酸銨、甲酸銨的重現(xiàn)性?xún)?yōu)于乙酸和甲酸。如必須使用甲酸等，0.2%優(yōu)于0.1%，不要使用磷酸。（4）水是最強(qiáng)的洗脫溶劑，所以強(qiáng)洗和弱洗溶劑與反相系統(tǒng)的正好相反：弱洗是初始流動(dòng)相，即高比例的有機(jī)相。并且進(jìn)樣溶劑最好是100%的有機(jī)相。1.HILIC柱如何平衡？ HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。2.HILIC柱如何保存？ HILIC柱使用 90%的乙腈水溶液保存。1.一直使用Waters 的HILIC較多，感覺(jué)質(zhì)量還行，但是要小心waters 的HILIC是分兩種類(lèi)型的填料的 BEH HILIC和 HILIC。很多waters 的銷(xiāo)售都不清楚之一點(diǎn)。但是大家一定要注意，這兩款的區(qū)別是很大的，保留的效果是不同的。2. 費(fèi)羅門(mén)公司的HILIC柱，感覺(jué)是小家碧玉型的，保留能力不是太強(qiáng)，但是清秀文雅， 峰型很好看。3. HILIC的 流動(dòng)相推薦使用乙腈。4. 推薦使用乙酸銨， 這也以后再說(shuō)。5.不能使用100% 的乙腈，推薦使用到95%就行了。 不能使用60%以下的乙腈。 所以梯度范圍小。但是足夠