蛋白酶活性的測定

1、.實驗四 蛋白酶活力的測定一、實驗?zāi)康?、了解蛋白酶活力測定的原理；2、掌握蛋白酶活力測定的方法。二、實驗原理蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質(zhì)中的肽鍵，也能夠水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質(zhì)或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測定蛋白酶的活力。本實驗選用酪蛋白為底物，測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。酪蛋白經(jīng)蛋白酶作用后，降解成相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸，在反應(yīng)混合物中加入三氯醋酸溶液，相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)和肽就沉淀下來，相對分子質(zhì)量較小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數(shù)量正比于酶的數(shù)量和反應(yīng)時間。在280nm波長下測定溶液吸光度的增加，就可計算酶的活力。三、實驗

2、試劑微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：稱取1.0g酶制劑，加100ml蒸餾水攪拌30min，在4下離心分離后，將上層清夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍數(shù)；0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5）；1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.5），加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、實驗步驟1、將5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37下保溫。2、取四支15ml具塞試管，分別標上記號A1、A0、B1和B0。在A1和A0試管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0試管中各吸入0.40ml酶液，分別用0.2mol/

3、L磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支試管都置于37水浴中保溫。3、在各試管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37下保溫10min（準確計時）后，再向A1和B1試管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、將試管從水浴中取出，在室溫下放置1h，用少量上清液潤濕濾紙后過濾，保留濾出液。5、在280nm波長下，分別以A0和B0濾液為空白，測定A1和B1濾液的吸光度。五、計算1、在規(guī)定的實驗條件下，以每分鐘增加0.001吸光度定義為一個酶單位。2、每克酶制劑中酶活力的計算： A1000/(tw) 酶活力單位/克酶制劑式中，A樣品與空白吸光度

4、差值（即A1和B1的吸光值）；t酶作用時間（本實驗為10min）；w反應(yīng)中酶的用量，g六、說明1、微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的PH范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45以下可保持較長時間的穩(wěn)定性。七、思考題1、蛋白酶有哪幾類？2、影響酶活力的因素有哪些？3、使用紫外分光光度計時應(yīng)注意哪些問題？六、數(shù)據(jù)記錄與處理A1 = 0.279 B1 = 0.573 酶含量為 0.001g/ml酶活力1 = A 1000 / (t w) = 0.2791000/10/0.001/0.20=1.395105酶活力單位/克酶制劑酶活力2= A 1000 / (t w) = 0

5、.5731000/10/0.001/0.40=1.4325105酶活力單位/克酶制劑平均值= （1.395105 + 1.4325105）=141375酶活力單位/克酶制劑平均相對相差= （143250 - 139500）/141375 100%=2.65% 七、思考題 1、蛋白酶有哪幾類？答：按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白質(zhì)或多肽的酰胺鍵。按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶微生物蛋白酶又可分為：細菌蛋白酶

6、、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白酶按蛋白酶作用的最適PH可以分為（A）PH2.55.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.510.5的堿性蛋白酶，（C）PH78的中性蛋白酶 2、影響酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化學反應(yīng)的速率來表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示，酶活力的測定也就是測定酶促反應(yīng)的速率。酶濃度對酶活力的影響：酶促反應(yīng)速率與酶分子的濃度呈正比，在一定范圍內(nèi)，當?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。底物濃度對酶活力的影響：若酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時，酶促反應(yīng)速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而

7、增加。當所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應(yīng)速度也不會增加。溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶活力將會下降。PH對酶活力的影響：酶在最適PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適PH，都會降低酶活性。激活劑對酶活力的影響：某些無機陽離子、陰離子、有機化合物可作為激活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強化其催化活性。抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力，它可降低酶促反應(yīng)速度。 3、使用紫外分光光度計時應(yīng)注意哪些問題？答：使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應(yīng)拿毛玻璃面的兩側(cè)，裝盛樣品量以2/3為