流式細胞術的設門方法

1、unljv讓寧擁II朮物流式細胞術數據分析目的就是需要確定所要研究的目的細胞器，這就涉及到 設門。設門就是劃定某一區(qū)域的細胞群體，對其單獨加以分析或分選。門的形狀 可任意，方法有幾種：（1）閾值設門。FSC （前向散射光）是最常用的閾值參數。 FSC和細胞的大小正相關。用 FSC設閾值，可以使低于該閾值的細胞碎片等 其他雜質的信號不被處理。（2）散射光設門。以FSC和SSC （側向散射光） 聯合設門較常用。其最大優(yōu)點是可以排除碎片或噪聲的干擾?？梢愿鶕﨔SC vsSSC散點圖上不同細胞分布不同來設門目的細胞群。另外還有熒光設門、反向設門和組合設門。流式細胞術的數據分析過程實際 上就是選門和設門

2、的過程。應該注意到設門是一個主觀行為，是人為做出的決定， 不同的人設門會存在很大差異，它是流式細胞術中最難掌握的技術。 因此，對設 門有2點需要把握：首先，設門盡可能客觀；其次，應該認識到設門需要主觀 決策。為了盡量減少主觀判斷帶來的誤差， 最好分選一些細胞用顯微鏡觀察來進 一步確認門的客觀性和準確性。流式細胞術的設門的注意事項：通過流式細胞術分析細胞樣品時，欲獲得更加準確的分析結果，應用最優(yōu)化的設 門策略非常重要。要考慮的因素包括：1）排除細胞碎片2）應用合適的熒光陰性對照3）排除死細胞.4）如果合適，使用一種共享標記物（比如 CD45白細胞標記或與之等效的泛- 細胞群標記）染色5）設置必需

3、的熒光分析點圖1）去除細胞碎片：在流式細胞儀上獲取數據時，建立一個前向散射（FSC）VS.側 向散射（SSC ）點圖，并通過調節(jié)各個光電倍增管裝置以確定所有要分析的細胞 群都在點圖的可視范圍內。在必要時，需要通過設置和調節(jié)FSC閾值，將大部分的細胞碎片、氣泡和激光背景噪的干擾排除在分析區(qū)域之外（都應該設在 FSC-low的區(qū)域）。接下來，在FSC vs SSC點圖中圈出感興趣的細胞群的周圍 區(qū)域（R1），這個區(qū)域可以被稱為 “R-FSC vs SSC。（裂解后的人全血FSC vs SSC 的典型設置）2）應用合適的熒光陰性對照：染細胞時，建議您將細胞分在兩個試管中，在其 中一個試管中，用熒光標

4、記的抗體染感興趣的細胞， 而另一個試管應用熒光同型un v讓中擁II朮物 抗體做為相應的陰性對照，這樣有助于在分析中更精確地區(qū)分陽性信號和陰性的 熒光背景。3）排除死細胞：通過Propidium Iodide （PI）或7-AAD等檢測細胞活性的標記染 細胞，以區(qū)分活細胞與死細胞。首先建立 FSC vs細胞活性染色”點圖，然后將“Region1 -FSC vs SSC設置在這個點圖上。之后，圈出活細胞群區(qū)域，稱為i“ Region 2Viable ”Unstained Control03n En.sdcudLjup.poMErnp-ldEd4）如果合適，使用一種共享標記物染色有時候，可以染一種

5、在感興趣的細胞與 其他細胞都有表達的標記（例如在所有白細胞上都表達的CD45,）。雖然這個步驟不是必須的，但對于分析一些稀少細胞類型時有幫助。首先，建立一個FSC vs共享標記物”的點圖，將“Region2-Viable設置于這個點圖上。然后，圈出所有 表達這個標記的細胞群，設為“ Region 3 - Shared Marker” 。PE Isotype Controlsc5）設置必需的熒光分析點圖，現在可以根據需要建立熒光分析點圖（例如，FSC vs FITC或FITC vs PE,等等）。確保將 “Region1 - FSC vs SSC， “Region2 Viable，和 “ Region3 - Shared Marker ”（如果適合的話）等各個門