動(dòng)物固體組織蛋白提取-Protocol

1、動(dòng)物固體組織蛋白提取-Protocol動(dòng)物固體組織蛋白提取 Protocol1、前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入75% 乙醇中 浸泡。早晨取出磁珠和勻漿管，自然晾干；也 可放入 烤箱中，速度較快。2、裂解液配制： RIPA : PMSF=100 : 1, 現(xiàn)配 現(xiàn) 用。（ 1000ulRIPA+10ulPMSF ）。置入 4C 冰 上。3、抽蛋白（應(yīng)冰上進(jìn)行）：a 適量組織（最好放入液氮中反復(fù)研磨成粉狀） 加入 裂解液中。一般 10ml 管體系中加入： 7-8 粒磁珠、 100mg 組織、 1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。b、勻漿。手工勻漿：將剪碎的組織倒入

2、玻璃勻漿管中， 再將剩 余的 1/3 勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒 杯中的碎 組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿， 左手持勻漿管 將下端插入盛有冰水混合物的器 皿中，右手將搗桿垂 直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研 磨數(shù)十次（ 6? 8 分鐘）， 充分研碎，使組織勻漿 化。機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī) 10000 ? 15000r/min 上下研 磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織 勻漿機(jī)制備 （勻漿時(shí)間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 3? 5次，在 冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織 等可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。 超聲粉碎：用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150 型超聲波發(fā)生器以振幅 14 微米超聲處

3、理 30 秒使細(xì)胞破碎，也可用國(guó)產(chǎn)超聲波發(fā) 生儀，用 40 安培， 5秒/次，間隙 10 秒反復(fù) 3? 5 次。 反復(fù)凍融：培養(yǎng)或者分離的細(xì)胞可以用以上的方 法勻 漿，也可以反復(fù)凍溶 3 次左右（即讓細(xì)胞加 適量的低 滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰， 溶 解，再結(jié)冰，再溶解，反復(fù) 3次左右），但有部 分酶 活力會(huì)受影響。c、將組織勻漿轉(zhuǎn)入1.5ml的EP管中（eppendorfI I 管、離心管）。 12000r/min 4 C 離心 15min 。d、離心后EP管中液體分三層，提取中間無色 液相, 移入新的 EP 管中?？?-80C 保存。4、蛋白濃度測(cè)定。a、配工作液：溶液 A :溶液B=

4、50: 1 (200ul: 4ul) o需測(cè)試復(fù)孔。標(biāo)本X，則需A量=2* (X+1+1 )*200 ; B=2* (X+1+1 ) *4。PWT AOSc、復(fù)孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlEP 管，再加入 54UIH2O，混勻。即10倍稀釋。d、取 20-25UI 10 倍稀釋蛋白樣本加入 96 孔板平 底 板內(nèi)，再加入 200UIAB 工作液，混勻振蕩后，37 C incubate 30min 。 注：應(yīng)現(xiàn)加蛋白樣本，再加工作液。因?yàn)槊看渭?蛋白后 需換tip，再加入工作液即起反應(yīng)，應(yīng)縮短時(shí)間。e、酶標(biāo)儀檢測(cè) 562nm 吸光度。 Programf、計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，如 Y

5、=1.2745X-0.1684 其中 Y : 蛋白 濃度； X : 吸光度。最終蛋白濃度為： 10*Y (ug/ul 、mg/ml ）g、蛋白樣本放 -80C 凍存。大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測(cè)定法定量。在 典型的 蛋白測(cè)定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶 液里產(chǎn)生顏 色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或 酶標(biāo)儀檢測(cè)，并 與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比 較。博士德為大家提 供兩種蛋白測(cè)定手段，每種 都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。如果 樣品數(shù)量較多，可以同 時(shí)使用兩種測(cè)定用酶標(biāo)儀自 動(dòng) 檢測(cè)。當(dāng)你選擇一 種蛋白測(cè)定方法時(shí)需要考慮兩個(gè)因 素： 緩沖液的 化學(xué)組成和檢測(cè)的蛋白量。Commassie 法（ Bradford

6、法）： 原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料 G-250 結(jié) 合，顏色從棕色變?yōu)樗{(lán)色，在 595nm 處檢測(cè)吸光值然 后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算出 待測(cè)蛋白的濃度。BCA 法：原理：在堿性條件下，蛋白將 Cu+ 還原為 Cu+ ， Cu+ 與 BCA 試劑形成紫色絡(luò)合物，測(cè)定 其在 562nm 處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比， 即可計(jì)算待測(cè)蛋白 的濃度?，F(xiàn)對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較：一、實(shí)驗(yàn)材料： 細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（ AR0103 ）M231BCA 蛋白定量試 劑盒（ AR0146 ）Commassie 改良增強(qiáng)型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145 ）二、操作步驟：Commassie 法：1. 將BS

7、A凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽水 或PBS 稀釋成 2000ug/ml ，1000 ug/ml,500 ug/ml,250ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。2. M231 用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。3. 各取 20ul 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè) M231 樣品至 相應(yīng) 標(biāo)記的微孔板中。4. 滴加200ul考馬斯增強(qiáng)型試劑（溶液 A）至每孔 混勻并充分震蕩 30S5. 停止震蕩，在室溫孵育樣品 10mi n6. 在酶標(biāo)儀中測(cè)量 595nm 時(shí)的吸光值。7. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的 蛋

8、白 濃度。BCA 法:1. 按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。2. 將BSA凍干標(biāo)準(zhǔn)品（10mg/支）用生理鹽 水或 PBS 稀釋成 2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml 八個(gè)濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。3. M231用細(xì)胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。4. 各取20ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)M231樣品至相應(yīng) 標(biāo)記的微孔板中。5. 滴加200UIBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S6. 停止震蕩，在37度孵育樣品30min7. 在

9、酶標(biāo)儀中測(cè)量562nm時(shí)的吸光值。8. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷出樣品的蛋白濃度。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 23456 7Commsie法吸光0.520.530.430.26 0.110.04 0.00值21281 10.03 0.017 7BCA法吸光值0.81 0.44 0.252470.14 0.06其中1到8為2000ug/ml ,1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625 的標(biāo)準(zhǔn)濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231 總蛋白 總、蛋白Commassie 法：ccnissil S4I600y =1069x 4 IL

10、 Y5000. 575 9為了測(cè)試準(zhǔn)確，應(yīng)在試劑加入后的 5? 20min內(nèi)測(cè) 定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定 的。由標(biāo) 準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為 14.4mg/mlCommassie法優(yōu)點(diǎn)是：1. 靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍， 其最低 蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1ug。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì) 與染料結(jié)合 后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染 料復(fù)合物有更高的 消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋 白質(zhì)濃度的變化比 Lowry法要大的多。2. 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一 個(gè)樣 品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與 蛋白質(zhì)結(jié) 合的過程，大約只要2分鐘即可完成， 其顏色可以在1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)

11、定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色 的穩(wěn)定性最好。3. 干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+ 、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰 基乙 醇、 EDTA 等均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：1. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基 酸的含 量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白 質(zhì)測(cè)定時(shí)有較 大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常 選用g球蛋白為 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的 偏差。2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干 擾物 質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100 、十二烷基硫 酸鈉 （SDS ）和 0.1M 的 NaOH 。（如同 0.1M 的酸干擾

12、 Lowary 法一樣）。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，在 0-1000ug/ml 濃 度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能 用 Beer 定律進(jìn)行計(jì) 算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè) 定未知蛋白質(zhì)的濃度。BCA 法：法就曲咗7500200015000.6 -500由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/mlBCA法特點(diǎn)：1.靈敏度高，檢測(cè)濃度下限 達(dá)到25 卩g/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5卩g待測(cè)樣品體積 為1-20卩I。2.測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可 以兼 容樣品中高達(dá) 5%的SDS , 5%的Trit on X-100 , 5% 的 Tween 20 , 6

13、0 , 80。3.在20-2000卩g/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。4. 檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量。5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影 響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低 于1mMBCA法和Commassie法各有優(yōu)勢(shì)，在不知 道蛋白 樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。) RIPA( Radio Immunoprecipitation Assay裂解液 (RIPA Lysis Buffer) 是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組 織快速 裂解液。 RIPA 裂解液裂解得到的蛋白樣 品可以用于常 規(guī)的 Western 、IP 等。R

14、IPA 使用方法對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：1. 融解 RIPA 裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液， 在 使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF ，使 PMSF 的最終 濃度為 1mM。2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS 、生理 鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍 ( 如果血清中的蛋白 沒有 干擾，可以不洗 ) 。按照 6 孔板每孔加入 150-250 微升 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹 打數(shù)下，使裂解液 和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液 接觸細(xì)胞 1-2 秒后，細(xì) 胞就會(huì)被裂解。 對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用 力彈 散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150-250 微升 裂解液的 比例加入裂解液。再用手指輕

15、彈以充分 裂解細(xì)胞。充 分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。 如果細(xì)胞量較多， 必需分裝成 50-100 萬細(xì)胞 /管， 然后再裂解。 裂解液用量說明：通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150 微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可 以適當(dāng)加 大裂解液的用量到 200 微升或 250 微 升。 對(duì)于組織樣品：1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。2. 融解 RIPA 裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液， 在 使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入 PMSF ，使 PMSF 的最終 濃度 為 1mM 。3. 按照每 20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液 的比 例加入裂解液。 （如果裂解不充分可以適當(dāng) 添加更多 的裂解液，如果

16、需要高濃度的蛋白樣 品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。 ）4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。5. 充分裂解后， 10000-14000g 離心 3-5 分鐘，取 上 清，即可進(jìn)行后續(xù)的 PAGE 、Western 和免疫 沉淀等 操作。6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切 后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈 vortex 使樣 品裂 解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。直接 裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿 器，缺點(diǎn)是不 如使用勻漿器那樣裂解得比較充 分。注： RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小 團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)

17、和基因組 DNA結(jié)合 特另【 緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別 緊密的蛋白， 則可以通過超聲處理打碎打散該透 明膠狀物，隨后離 心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果 檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因 子，例如NF k B、p53等 時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處 理，就可以檢測(cè)到這些 轉(zhuǎn)錄因子。各種RIPA的差別及用途稱及名 品 產(chǎn)weF液解PA裂解液裂解液PA裂解液（動(dòng)NF 解 4液裂液沁液（測(cè)(0S001% N有成001o 7S分解隔% p1%SS裂A1o% 1%;UO04 M p xp效DS hs Todops N %裂解強(qiáng)度強(qiáng)中強(qiáng)好好艮艮艮子艮子艮子艮子艮子艮子的提取

18、對(duì)核蛋白的較好很好較好較好較好很好提取胞漿磷酸化很好很好很好很好很好很好蛋白提取細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄很好很好很好很好很好很好因子提取含蛋白酶抑是是是是是是制劑含磷酸酯酶是是是是是是抑制劑WB,WB,WB,主要用途W(wǎng)B, IPWB, IPWB, IP, co-IPIP,co-IPIP,co-IP ChIP蛋白酶及蛋白酶抑制劑大全摘要：破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了 5種常用的蛋白酶抑制劑和他們各 自的作用特點(diǎn)，因?yàn)楦鞣N蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要 調(diào)整各種蛋白酶的濃度

19、。蛋白酶抑制劑破碎細(xì)胞提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可釋放出蛋白 酶，這 些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì) 不被降解。 在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白 酶抑制劑以防止 蛋白水解。以下列舉了 5種常用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點(diǎn)，因?yàn)楦鞣N蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應(yīng)注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時(shí)應(yīng)充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。在寶靈曼公司的目錄上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制劑表。常用抑制劑PMSF Phe nylmetha nesulfo nyl fluoride(劇毒)1) 抑制絲氨酸蛋白酶 (如胰凝乳蛋

20、白酶，胰蛋 白酶，凝血酶 )和巰基蛋白酶 (如木瓜蛋白酶 );2) 10mg/ml 溶于異丙醇中 ；3) 在室溫下可保存一年 ；2-8 C 可以存放數(shù)月 之 久。欲長(zhǎng)期保存，可凍存在 -20 C4) 工作濃度 : 仃? 174ug/ml (0.1? 1.0mmol/L ); 儲(chǔ)存液濃度為 100 或 200mM5) 在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一分離和 純 化步驟中加入新鮮的 PMSF 。EDTA1) 抑制金屬蛋白水解酶 ；2) 0.5mol/L 水溶液， pH8? 9;3) 溶液在 4 C 穩(wěn)定六個(gè)月以上 ;4) 工作濃度 :0.5? 1.5mmol/L.(0.20.5mg/ml);5)

21、加入 NaOH 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值，否則 EDTA 不溶 胃蛋白酶抑制劑 (pepstantin)1) 抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原 酶，組織蛋白酶 D 和凝乳酶 ；2) 1mg/ml 溶于甲醇中 ；3儲(chǔ)存液在4 C 一周內(nèi)穩(wěn)定，-20 C穩(wěn)定6個(gè)月；4) 1 作濃度 :0.7ug/ml(1umol/L)5) 在水中不溶解。亮抑蛋白酶肽 (leupeptin)1) 抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶， 漿酶和組織蛋白酶 B;2) lOmg/ml 溶于水 ；3) 儲(chǔ)存液 4 C 穩(wěn)定一周， -20 C 穩(wěn)定 6 個(gè)月；4) 工作濃度 0.5mg/ml 。胰蛋白酶抑制劑 (aprot

22、inin) 1)抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素， 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 ；2)IOmg/ml 溶于水， pH7? 83儲(chǔ)存液4 C穩(wěn)定一周，-20 C穩(wěn)定6個(gè)月;4) 工作濃度:0.062.0ug/ml(0.010.3umol/L);5) 避免反復(fù)凍融 ：6) 在 pH12.8 時(shí)失活。 蛋白酶抑制劑混合使用35ug/mlPMSF 絲氨酸蛋白酶抑制劑0.3mg/mlEDTA 金屬蛋白酶抑制劑0.7ug/ml 胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin) 酸性蛋白酶抑制劑0.5ug/ml 亮抑蛋白肽酶(Leupept in)廣譜蛋白酶抑制劑(Leupept in)廣譜蛋白酶抑制劑常用蛋白酶抑制劑

23、表抑制劑靶蛋白酶有效濃度儲(chǔ)藏溶液注解An tipai n木瓜酶和胰酶50 卩 g/ml1mg/ml水溶液對(duì)胰凝蛋白酶，胃液 素，纖溶酶無影響APMSF胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶10-40 卩 g/ml 或10- 20 創(chuàng)100mmol/L水溶液毒性比PMSF低，不 能抑制胰凝蛋白酶 或乙酰膽堿酯酶抑肽酶絲氨酸蛋白酶0.06- 2 卩 g/ml10mg/mlPBS 溶液避免反復(fù)動(dòng)凍融抑氨肽酶B氨基肽酶40 卩 g/ml溶于甲醇不能抑制羧肽酶Calpa in抑制劑1、nCalpain (鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶)I :17 卩 g/ml n :7 卩g/ml溶于乙醇可滲透薄膜抑糜朊酶素胰凝乳蛋白酶6-6

24、0 卩 g/ml溶于DMSOB.M.綜合酶片絲氨酸，半胱氨酸和 金屬蛋白酶每10-50ml細(xì)胞提取液內(nèi)加一片不含EDTAEDTA金屬蛋白酶0.2-0.5mg/ml 或0.5- 1.3 卩 mol/L500mmol/L水溶液pH=8.0抑蛋白酶醛肽絲氨酸蛋白酶，巰基 蛋白酶0.5- 2 卩 g/ml10mg/ml水溶液a2-巨球蛋白廣譜：1 U /ml100 U /ml PBS 溶液避免接觸還原劑Pefabloc SC(boe- hrin ger Mann heim)絲氨酸蛋白酶0.1-1.0mg/ml 或0.4-4mmol/L100mM水溶液無毒，在中性 pH下較PMSF 穩(wěn)定胃蛋白酶抑制劑酸性蛋白酶0.7 卩 g/ml1mg/ml甲醇溶液PMSF絲氨酸蛋白酶17-170 卩 g/ml10mg/ml異丙醇溶液每一操作步驟時(shí)新鮮加入TL