哺乳細(xì)胞表達(dá)載體

1、這個(gè)是我根據(jù)個(gè)人的實(shí)驗(yàn)需要整理的哺乳細(xì)胞表達(dá)載體的資料， 望指正Invitrogen 公司Invitrogen 公司擁有最豐富的表達(dá)載體，包括原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。其中真核表達(dá)系統(tǒng)中哺乳細(xì)胞表達(dá)的主要有FRT系統(tǒng)、GW系統(tǒng)、DEST系統(tǒng)、pcDNA系統(tǒng)、pRc系統(tǒng)等（詳細(xì)資料請(qǐng)看表 1），他們分別有自己的特性。其中FRT 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞后會(huì)形成相同基因的細(xì)胞，但必須和 FIp 重組表達(dá)載體 pOG44 共 轉(zhuǎn) 染 FIp 細(xì) 胞 ， 增 加 了 操 作 時(shí) 間 和 難 度 。 DEST 系 統(tǒng) 在 attR1,attR2;ccdB;CmR;TEV 用于切割 V5 抗原。 pRc 系統(tǒng)在 MC

2、S 處有 2 個(gè) BstXI 酶切位點(diǎn)。還有可以表達(dá)兩個(gè)外源蛋白的 pBudCE4 載 體 ； pCMV/Zeo,pSV40/Zeo 和 pCMV/Bsd,pEF/Bsd,pUB/Bsd 分別是 用于 在一新 載體上構(gòu) 建 Zeo/Bsd 抗性的盒式載體。 pcDNA 系統(tǒng)種類繁多， 是最為普遍常 用，其中分類詳細(xì)，有帶 tag 的，也有無(wú) tag 的，分別構(gòu)建了由 CMV/Ub/EF-1a 啟 動(dòng) 子 ， 在 N 端 /C 端 增 加 myc-6*His/V5-6*His/6*His tag 以 形 成 融 合 蛋 白 以 及 Neo/Zeo/Bsd 三種抗性基因逐一不同組合形成的哺乳細(xì)胞表

3、達(dá) 載體，充分滿足多方面實(shí)驗(yàn)要求。所以我們著重參考此類載體。pcDNA 系列載體 Invitrogen 公司開發(fā)的適用于哺乳細(xì)胞表達(dá) 的真核表達(dá)載體，有28個(gè)之多，由于部分載體有 3個(gè)ORF,所以可形成 68 種重組質(zhì)粒。組分：影響表達(dá)的主要因素： CMV/Ub/EF-1a 啟動(dòng)子、均無(wú)內(nèi)含 子序列， Neo/Zeo/Bsd/Hyg 四種抗性基因、 T7 RNA 聚合酶啟動(dòng) 子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及 BGH polyA 、f1+pUC+SV40 復(fù)制起始子。 特性：均可瞬時(shí) / 穩(wěn)定表達(dá)。各組分分別逐一組合成不同載體， 選擇性強(qiáng)，可滿足各種實(shí)驗(yàn)需要，在N端/C端增加 myc-6*His/V5-6*

4、His/6*His tag 以形成融合蛋白。其中 pcDNA4/HisMax 載體表達(dá)高； 在 CMV 啟動(dòng)子基礎(chǔ)上增加了 SP163 增強(qiáng)子； N 端有 6*His-Xpress tag ，易于檢測(cè)和純化；且 篩選壓力是Zeo，較G418篩選快且便宜；同時(shí)在此基礎(chǔ)上構(gòu)建 了可用TOPO方式克隆的載體，便于 PCR產(chǎn)物的直接克隆。不含 tag 的 pcDNA3.1 載體系列，具有 CMV 的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子； 表達(dá)產(chǎn)物不含多余的 N 末端和 C 末端，即省去了表達(dá)后切去 tag 的工作。除以上所列出的載體外該公司還有靶向亞細(xì)胞單位的載體pEF系列、pCMV系列等；用于基因治療的pGT系列；在犬科

5、細(xì)胞系 表達(dá)抗原的 pREF、 pCEP4、 pEBVhis 等；還有利用熒光分析的 pTrace 系列。而對(duì)本課題而言，最適合的是 pcDNA 系列和 pZeoSV2。Stratagene 公司Stratagene公司的產(chǎn)品包括：pExchange系列、pCMV-Tag系列、 pDual系列、pBK-CMV,還有瞬時(shí)表達(dá)的 pSG5等等。pExchange 系列沒有抗性基因， 操作時(shí)必須在完成了目的基因的克隆后再將 藥物抗性基因插入載體，操作復(fù)雜。 pCMV-Tag 系列是分別在 N 端和C端附加了 FLAG/c-myc tag，但其中4個(gè)載體具有多 ORF 特性，轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中容易發(fā)生錯(cuò)誤

6、。組分：影響表達(dá)的主要因素：CMV啟動(dòng)子（pBK-CMV的啟動(dòng)子 是經(jīng)過(guò)突變后的CMV啟動(dòng)子）、不含內(nèi)含子序列（除pSG5外）、 Neo 抗性基因、原核抗性基因有 Kan 和 Amp 兩種、 T7+T3 RNA 聚合酶啟動(dòng)子（pSG5和pDual系列是僅有T7啟動(dòng)子）、轉(zhuǎn)錄終 止信號(hào)以及 SV40 polyA、f1+pUC+SV40 復(fù)制起始子（pSG5僅 含有 f1 ori ）。特性：部分載體含有 RBS/kozak （ gcca/gccatgg ）序列； SV40 有早期和晚期兩種 polyA 信號(hào)；在抗性基因 Neo 上下游分別有 b-lac啟動(dòng)子/SV40ori和TK polyA信號(hào)；

7、分別在N端和C端有tag， 表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白。其中 pBK-CMV 和 pDual 都增加了 lac O/Z 基因，可在 E.coli 中 進(jìn)行蘭白斑篩選； 均可原核 /真核表達(dá)； pDual 的終止序列是 SV40 晚期 polyA ，比早期 polyA 效果要好；還有凝血酶酶切位點(diǎn)。Novagen 公司Novagen 公司開發(fā)了的表達(dá)載體中有一個(gè)系列是可在 3 種表達(dá) 系統(tǒng)（原核、昆蟲、哺乳細(xì)胞）中表達(dá)的，以表達(dá)形式分可分為 瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)兩種。 瞬時(shí)表達(dá)的是 pTrEx 系列， 穩(wěn)定表達(dá) 載體是在此基礎(chǔ)上增加了有增強(qiáng)子 CITE 控制的藥物抗性基因 Hyg/Neo ，其他特性與瞬時(shí)

8、表達(dá)載體無(wú)異。 組分：影響表達(dá)的主要因素： CMV/b-actin 啟動(dòng)子、 CMV 增強(qiáng)子、 有內(nèi)含子序列、T7終止序列以及兔b-球蛋白polyA，以及T7 lac 啟動(dòng)子（利于在 E.coli 中誘導(dǎo)表達(dá)）、 pUC 復(fù)制起始子。特性：C 端有 His、 HSV tag ， pTriEx-2/4 在 N 端有 His tag ，表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白；MCS中含有p10 （利于在昆蟲細(xì)胞表達(dá)）和 凝血酶、腸激酶酶切位點(diǎn)，可切去 N端的tag ;除此以外，在 MCS兩端每個(gè)ORF上都有平末端的酶切位點(diǎn)以利于克隆。此 外 還 有 載體 系 列 ：Blue Star, Duet, M13 mp18,