SDS-PAGE電泳檢測[互聯(lián)網+]

1、周 次第 周，第 次課編寫時間2012章節(jié)名稱實驗一、蔗糖酶的提取及其性質的研究分離產物的SDS-PAGE電泳檢測授課方式課堂講授（ ），實踐課（ ）教學時數(shù)6時間分配授課要點教學重點和難點重點：1.SDS聚丙烯酰胺電泳法的原理。 2.測定蛋白質的分子量的方法難點：SDS-PAGE的操作方法教學內容1、 實驗目的1.掌握SDS聚丙烯酰胺電泳法的原理。 2.學會用此種方法測定蛋白質的分子量二、實驗原理 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是對蛋白質進行量化，比較及特性鑒定的一種經濟、快速、而且可重復的方法。該法主要依據(jù)蛋白質的分子量對其進行分離。SDS與蛋白質的疏水部分相結合，破壞其折疊

2、結構，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質復合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。SDSPAGE因易于操作和廣泛的用途，使它成為許多研究領域中一種重要的分析技術。 SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質與SDS的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質），使各種蛋白質SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)

3、量遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，于是根據(jù)標準蛋白質分子量的對數(shù)和遷移率所作的標準曲線，可求得未知物的分子量。3、 實驗儀器及試劑實驗儀器微型凝膠電泳裝置；電源（電壓200V，電流500mA）；100沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50l或100l）；干膠器、真空泵或水泵；帶蓋的玻璃或塑料小容器；搖床等。試劑 2mol/l Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH8.8（約加4ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加蒸餾水至100ml。授

4、課要點教學內容 1mol/l Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸餾水，緩慢的加濃鹽酸至pH6.8（約加8ml）；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加蒸餾水至100ml。 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸餾水至100ml。 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，加入50ml蒸餾水。 1% (w/v) 溴酚藍:取100mg溴酚藍，加蒸餾水至10ml，攪拌,直到完全溶解，過濾除去聚合的染料。 A液-丙烯酰胺儲備液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉雙丙烯酰胺的溶液100ml）在通風柜中操作，取29.2

5、g丙烯酰胺，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100ml，緩慢攪拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蠟膜封口，可在4存放數(shù)月。 B液-4分離膠緩沖液：取75ml 2mol/l Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸餾水，混勻，可在4存放數(shù)月。 C液-4濃縮膠緩沖液:取50ml 1mol/l Tris-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸餾水，混勻，可在4存放數(shù)月。 10%過硫酸銨：取0.5g過硫酸銨，加入5ml蒸餾水，可保存在密封的管內，于4存放數(shù)月。 電泳緩沖液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸餾水至1l,

6、 pH約為8.3, 也可配制成10的儲備液，在室溫下長期保存。 5樣品緩沖液：取0.6ml 1mol/l Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巰基乙醇，1ml 1%溴酚藍，0.9ml的蒸餾水混勻，可在4保存數(shù)周，或在-20保存數(shù)月。 考馬斯亮藍染液：1.0g 考馬斯亮藍R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸餾水及100ml冰醋酸即成。 考馬斯亮藍脫色液：將100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸餾水混勻備用。四、操作步驟1.灌制分離膠 組裝凝膠模具: 可按照使用說明書裝配好灌膠用的模具。對于Bio-Rad的微型凝膠電

7、泳系統(tǒng)，在上緊螺絲之前，必須確保凝膠玻璃板和隔片的底部與一個平滑的表面緊密接觸，有細微的不匹配就會導致凝膠的滲漏。 將A液、B液及蒸餾水在一個小燒瓶或試管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神經毒素，操作時必須戴手套。加入過硫酸銨和TEMED后，輕輕攪拌使其混勻(過量氣泡的產生會干擾聚合)。凝膠很快會聚合，操作要迅速。小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內，這樣可以避免在凝膠內產生氣泡。 當加入適量的分離膠溶液時(對于小凝膠，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm)，輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層1mm5mm的水層，這使凝膠表面變得平整。當凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會出現(xiàn)一個清

8、晰的界面。2. 灌制濃縮膠 吸盡覆蓋在分離膠上的水后將A液、C液和蒸餾水在三角燒瓶或小試管中混合。加入過硫酸銨和TEMED，并輕輕攪拌使其混勻。 將濃縮膠溶液用吸管加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。將梳子插入凝膠內，直至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。必須確保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產生。 凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。將凝膠放入電泳槽內，如果使用Bio-Rad的微型凝膠系統(tǒng)，可預先接好電極。將電泳緩沖液加入內外電泳槽中，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。3.制備樣品和上樣 將蛋白質樣品與5x樣品緩沖液(20l 5l)在一個Eppe

9、ndorf管中混合。100加熱2 min10min。離心1s，如果有大量蛋白質碎片則應延長離心時間。 用微量注射器將樣品加入樣品孔中。將蛋白質樣品加至樣品孔的底部，并隨著染料水平的升高而升高注射器針頭。避免帶入氣泡，氣泡易使樣品混入到相鄰的加樣孔中。4.電泳 將電極插頭與適當?shù)碾姌O相接。電流流向陽極。將電壓調至200V（保持恒壓；對于兩塊0.75mm的膠來說，電流開始時為100mA，在電泳結束時應為60mA；對于兩塊1.5mm的膠來說，開始時應為110mA，結束時應為80mA。）。 對于兩塊0.75mm的凝膠，染料的前沿遷移至凝膠的底部約需3040分鐘(1.5mm的凝膠則需40 min50mi

10、n)。關閉電源,從電極上拔掉電極插頭,取出凝膠玻璃板,小心移動兩玻璃板之間的隔片，將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板，凝膠便會貼在其中的一塊板上。5.考馬斯亮藍染色 這種染色方法在單條電泳帶中蛋白質最小檢出量為0.1g的蛋白。通?？梢愿鶕?jù)所需要的敏感度來選擇是使用考馬斯亮藍染色或銀染色。 戴上手套避免將手指印留在電泳凝膠上，將凝膠移入一個小的盛有少量考馬斯亮藍(20ml已經足夠)的容器內(小心不要將膠撕破)?；驅⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直至凝膠脫落。 對于0.75mm的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩5分鐘l0分鐘，對于1.5mm的凝膠，則需10分鐘20分鐘，在染色和脫色過程中要用蓋子或

11、封口膜密閉容器口。棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色。 加入考馬斯亮藍脫色液(約50ml)，清晰的條帶很快會顯現(xiàn)出來，大部分凝膠脫色需要1h，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜。6.干膠 用一張l0cml2cm的Whatman 3MM濾紙覆蓋凝膠，用一張玻璃紙或塑料保鮮膜覆蓋在凝膠的另一個表面，小心不要將氣泡裹進去，這樣會導致凝膠的破裂。可用一個試管作為卷軸推趕，可以有效的除去氣泡。 將濾紙置于干膠器上，開啟加熱和抽真空開關，并蓋上帶有密封圈的蓋子。待凝膠烘干后小心取出即可。五、結果觀察根據(jù)凝膠中標準品與待測樣品的相對遷移率判斷待測樣品的大致分子量。本次課程采用的教學手段（啟發(fā)式、討論式、研究式等教學方法及教學儀器設備）啟發(fā)式、研究式思考題或作 業(yè) 利用SDS聚丙烯酰胺電泳法測定蛋白質的分子量與利用凝膠層析測定蛋白質的分子量有何不