實驗三藥物血漿蛋白結(jié)合率測定ppt課件

1、實驗三實驗三 藥物血漿蛋白結(jié)合率測定藥物血漿蛋白結(jié)合率測定測定方法測定方法l平衡透析法平衡透析法l超越濾法超越濾法l分配平衡法分配平衡法l穩(wěn)定同位素穩(wěn)定同位素-GC-MS法法l凝膠過濾法凝膠過濾法l光譜技術(shù)光譜技術(shù)平衡透析法平衡透析法l根本原理根本原理l 將蛋白置于一個隔室內(nèi)，用半透膜將此隔將蛋白置于一個隔室內(nèi)，用半透膜將此隔室與另一隔室隔開。蛋白等大分子不能經(jīng)過此室與另一隔室隔開。蛋白等大分子不能經(jīng)過此半透膜，但系統(tǒng)中游離配基可自在經(jīng)過。當(dāng)?shù)桨胪改?，但系統(tǒng)中游離配基可自在經(jīng)過。當(dāng)?shù)竭_(dá)平衡時半透膜兩側(cè)自在配基的濃度相等。假達(dá)平衡時半透膜兩側(cè)自在配基的濃度相等。假設(shè)系統(tǒng)中自在配基的總量知，測定不

2、含蛋白隔設(shè)系統(tǒng)中自在配基的總量知，測定不含蛋白隔室中自在配基的濃度，即可推算與蛋白結(jié)合的室中自在配基的濃度，即可推算與蛋白結(jié)合的配基量。配基量。重氮化巧合比色測定法重氮化巧合比色測定法具有游離氨基的磺胺藥在酸性介質(zhì)中重氮化后，具有游離氨基的磺胺藥在酸性介質(zhì)中重氮化后，可與可與N-(1萘基乙二胺產(chǎn)生巧合反響生成紫紅色萘基乙二胺產(chǎn)生巧合反響生成紫紅色偶氮染料，再與同樣處置的磺胺藥規(guī)范液比較，偶氮染料，再與同樣處置的磺胺藥規(guī)范液比較，即可求得磺胺藥的含量。即可求得磺胺藥的含量。剩余的亞硝酸影響測定，用氨基磺酸胺分解除去剩余的亞硝酸影響測定，用氨基磺酸胺分解除去資料與試劑資料與試劑 藥物藥物 10%磺

3、胺嘧啶鈉注射液磺胺嘧啶鈉注射液 試劑試劑15%三氯醋酸溶液三氯醋酸溶液0.1%亞硝酸鈉溶液亞硝酸鈉溶液0.5%氨基磺酸胺溶液氨基磺酸胺溶液0.1%二鹽酸二鹽酸N-1萘基萘基-乙二胺溶液乙二胺溶液磺胺嘧啶鈉儲存規(guī)范液磺胺嘧啶鈉儲存規(guī)范液磺胺嘧啶鈉運用規(guī)范液磺胺嘧啶鈉運用規(guī)范液 透析液透析液 PBS pH7.4的的 0.02M 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液 雞、兔各三只雞、兔各三只 管狀半透膜管狀半透膜 周長周長5cm，長約，長約12cm721分光光度計、離心機(jī)、天平分光光度計、離心機(jī)、天平注射器、廣口瓶、燒杯、三角燒瓶、試管、注射器、廣口瓶、燒杯、三角燒瓶、試管、試管架、漏斗、濾紙、絲線、注射器試管

4、架、漏斗、濾紙、絲線、注射器設(shè)備與器械設(shè)備與器械試劑的配制試劑的配制 0.02M, PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液磷酸鹽緩沖鹽液( PBS) ： 儲存液：儲存液： A液：液：0.2M Na2HPO4 Na2HPO412H2O 71.64克，加蒸餾水至克，加蒸餾水至1000ml； B液：液： 0.2M NaH2P4 NaH2P42H2O 12克，加蒸餾水至克，加蒸餾水至1000ml； 運用液：取運用液：取A液液81ml加加B液液19ml混合，再以生理鹽水混合，再以生理鹽水作作10倍稀釋即成。倍稀釋即成。試劑的配制試劑的配制0.1%二鹽酸二鹽酸N-1萘基萘基-乙二胺溶液乙二胺溶液 0.5 g溶于溶于95

5、 %乙醇約乙醇約400 mL中，再用乙醇稀釋至中，再用乙醇稀釋至500ml，棕色瓶于冰箱中保管棕色瓶于冰箱中保管儲存規(guī)范液儲存規(guī)范液 取規(guī)范品取規(guī)范品0.125g溶于蒸餾水中，并溶于蒸餾水中，并稀釋至稀釋至1000mL。如不溶于水，可先溶于。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L氫氧化鈉氫氧化鈉25mL中，再加中，再加4mol/L硫酸硫酸175 mL，用蒸餾水稀釋至，用蒸餾水稀釋至1000mL。運用規(guī)范液運用規(guī)范液 準(zhǔn)確汲取儲存規(guī)范液準(zhǔn)確汲取儲存規(guī)范液3mL，置，置100 mL容量瓶中，用容量瓶中，用3%三氯醋酸稀釋至刻度。三氯醋酸稀釋至刻度。操作步驟操作步驟1. 血漿的制備：兔心臟采血雞翼靜

6、脈采血，血漿的制備：兔心臟采血雞翼靜脈采血，肝素抗凝，以肝素抗凝，以3000rpm離心離心10min，上清液即，上清液即為血漿。為血漿。 2. 將管狀半透膜一端折疊，用紗線扎緊，保管結(jié)將管狀半透膜一端折疊，用紗線扎緊，保管結(jié)扎線段扎線段10cm左右，以調(diào)理袋內(nèi)外液面在同一程左右，以調(diào)理袋內(nèi)外液面在同一程度，加血漿樣品度，加血漿樣品2.0ml于上述半透膜袋內(nèi)，并扎于上述半透膜袋內(nèi)，并扎緊口袋另一端。留意：袋口不得污染血漿。緊口袋另一端。留意：袋口不得污染血漿。3. 將兩端扎緊的半透膜置于盛有將兩端扎緊的半透膜置于盛有9.75ml透析液的透析液的30ml廣口瓶中，用袋兩端線段調(diào)理袋內(nèi)外液面廣口瓶中

7、，用袋兩端線段調(diào)理袋內(nèi)外液面4. 加加2.0ml透析液替代血漿于半透膜袋內(nèi)，作平透析液替代血漿于半透膜袋內(nèi)，作平衡時間對照樣品，以確定藥物從袋內(nèi)外自在分衡時間對照樣品，以確定藥物從袋內(nèi)外自在分散到達(dá)平衡所需時間。散到達(dá)平衡所需時間。5. 加所試磺胺藥溶液加所試磺胺藥溶液0.25ml于各瓶袋外透析液中。于各瓶袋外透析液中。留意：容積越小越好，以免影響透析液的組成留意：容積越小越好，以免影響透析液的組成6. 置廣口瓶于冰箱中，平衡透析時間約需置廣口瓶于冰箱中，平衡透析時間約需60h左左右。右。7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少許，加等待透析平衡后，吸出袋外透析液少許，加等量磺基水楊酸試劑，檢查有

8、無血漿蛋白漏出。量磺基水楊酸試劑，檢查有無血漿蛋白漏出。如檢查為陽性，那么該樣品作廢。如檢查為陽性，那么該樣品作廢。8. 取出半透膜，用濾紙吸干袋外壁透析液，小取出半透膜，用濾紙吸干袋外壁透析液，小心解開透析袋，使袋內(nèi)血漿流入干凈試管。心解開透析袋，使袋內(nèi)血漿流入干凈試管。9. 用重氮化用重氮化-巧合比色法測定袋內(nèi)外溶液中磺胺藥濃度巧合比色法測定袋內(nèi)外溶液中磺胺藥濃度 取袋內(nèi)外溶液各取袋內(nèi)外溶液各0.5ml，加水，加水15.5ml；加；加15%三氯醋酸三氯醋酸4ml，混勻，靜置，混勻，靜置2min，過濾，過濾 取試管取試管3支，各參與濾液支，各參與濾液5mL，為測定管，為測定管 取試管取試管3

9、支，參與空白對照液支，參與空白對照液5mL，為空白管，為空白管 取試管取試管3支，參與運用規(guī)范液支，參與運用規(guī)范液5mL，為規(guī)范管，為規(guī)范管 在以上各管中各參與在以上各管中各參與0.1%亞硝酸鈉溶液亞硝酸鈉溶液0.5mL，混勻，混勻，放置放置3min各參與各參與0.5%氨基磺酸胺溶液氨基磺酸胺溶液0.5mL，混勻，放，混勻，放 置置2min 各參與各參與0.1%二鹽酸二鹽酸N-1萘基萘基-乙二胺溶液乙二胺溶液 2.5mL，充分混勻，放置，充分混勻，放置10min用用721分光光度計在分光光度計在550nm波優(yōu)點比色波優(yōu)點比色 以空白管校正光密度到以空白管校正光密度到0點，讀取規(guī)范管和點，讀取規(guī)范管和 測定管光密度，計算游離磺胺藥物含量測定管光密度，計算游離磺胺藥物含量10. 計算血漿蛋白結(jié)合率計算血漿蛋白結(jié)合率計算公式計算公式 測定管光密度測定管光密度游離磺胺藥含量游離磺胺藥含量 mg%= 規(guī)范管光密度規(guī)范管光密度