微生物的培養(yǎng)與分離一輪學(xué)案

1、微生物的分離和培養(yǎng)【考綱要求】 微生物的分離和培養(yǎng) B 【復(fù)習(xí)要求】1.理解培養(yǎng)基對微生物的選擇利用并能利用選擇培養(yǎng)基分離微生物2.掌握培養(yǎng)微生物的過程、條件和方法3.掌握測量微生物數(shù)量的方法、統(tǒng)計菌落數(shù)量的方法4.能利用選擇培養(yǎng)基分離微生物的方法 【基礎(chǔ)知識】一、微生物的實驗室培養(yǎng)1培養(yǎng)基 （1）概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。（2）成分：一般都含有碳源、氮源、水和無機(jī)鹽，還需滿足不同微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。營養(yǎng)要素來源功能碳源無機(jī)氮源CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳無機(jī)物構(gòu)成細(xì)胞中的物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；既是碳源又是能源有機(jī)

2、碳源糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、石油、花生粉餅等氮源無機(jī)氮源無機(jī)氮：NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等將無機(jī)氮合成含氮的代謝產(chǎn)物有機(jī)氮源牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶和核酸的組成成分；參與代謝過程中的酶促反應(yīng)（3）分類和應(yīng)用劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運(yùn)動、分類、鑒定 培養(yǎng)基微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種化學(xué)成分 培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn) 培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確(用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成)分類、鑒定用途 培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以

3、抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物(如培養(yǎng)酵母菌和霉菌，可在培養(yǎng)基中加入 ；培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，可在培養(yǎng)基中加入高濃度 ) 培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物，如可用添加 的培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)2無菌技術(shù) 消毒和滅菌的區(qū)別條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部的部分對人有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法牛奶等化學(xué)藥劑、物理消毒法用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源；紫外線消毒滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，

4、包括芽孢和孢子灼燒滅菌法接種工具_(dá)滅菌法玻璃器皿、金屬工具_(dá)滅菌法培養(yǎng)基及容器的滅菌三種常用滅菌方法的比較滅菌方法適用材料或用具滅菌條件滅菌時間灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、涂布器或其他金屬工具酒精燈火焰的充分燃燒層直至燒紅干熱滅菌玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等干熱滅菌箱內(nèi)， 1 h2 h高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基等高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi) kPa， 15 min30 min3實驗操作(1)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的制備計算稱量熔化滅菌倒平板。(2)微生物的分離方法： 劃線法 平板法微生物的計數(shù)方法： 方法平板劃線法稀釋涂布平板法注意事項(1)接種環(huán)的灼燒：第一次劃線前：接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物每次劃線

5、前：殺死殘留菌種，保證每次劃線菌種來自_劃線末端劃線結(jié)束后：殺死殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者(2)灼燒接種環(huán)之后，要_后再進(jìn)行操作，以免溫度太高殺死菌種(3)劃線時最后區(qū)域不要與第_區(qū)域相連(4)劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基_。(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應(yīng)離火焰12 cm處(2)涂布平板時：涂布器用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精酒精燈與培養(yǎng)皿距離要合適，移液管管頭不要接觸任何物體目的在培養(yǎng)

6、基上形成由單個菌種繁殖而來的子細(xì)胞群體菌落培養(yǎng)平板冷凝后 培養(yǎng)，使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，防止皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基造成污染。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)1分離原理：土壤中細(xì)菌之所以能分解尿素，是由于它們體內(nèi)能合成脲酶 ，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機(jī)物的過程中 起到催化作用。2菌種篩選：使用_是唯一氮源的_培養(yǎng)基培養(yǎng)。3統(tǒng)計菌落數(shù)目：常用方法有 、顯微鏡直接計數(shù)法。直接計數(shù)法：這種方法是利用血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點是不能區(qū)分死菌與活菌。（但用亞甲基藍(lán)染色后，死細(xì)胞是藍(lán)色，活的是無色的）間接計數(shù)法(活菌計數(shù)法)：稀釋涂布平板法，常用來統(tǒng)計樣品中

7、的活菌數(shù)。此法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的。4實驗流程：土壤取樣制備培養(yǎng)基微生物的培養(yǎng)與觀察細(xì)菌的計數(shù)。5觀察記錄結(jié)果：每克土壤樣品菌數(shù)某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。思考：如何進(jìn)行系列稀釋？某稀釋倍數(shù)指哪一個倍數(shù)？計算值和真實值之間的關(guān)系？為什么？6.鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑， 若pH升高，指示劑變 ，說明細(xì)菌能分解尿素。三、分解纖維素的微生物的分離1纖維素酶：一種復(fù)合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。2纖維素分解菌的篩選原理 剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)

8、合物，但并不和二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。纖維素分解菌能產(chǎn)生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。3. 篩選方法：(1) 鑒定方法： 染色法，即通過是否產(chǎn)生_來篩選纖維素分解菌。(2) 篩選：以 為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基。4土壤中纖維素分解菌的篩選實驗流程土壤取樣（富含 的環(huán)境）選擇培養(yǎng)（用_培養(yǎng)基培養(yǎng)，目的是增加纖維素分解菌的數(shù)量）梯度稀釋涂布平板（將樣品涂布到_纖維素分解菌的培養(yǎng)基上）挑選產(chǎn)生 的菌落（產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍出現(xiàn) ）?！玖?xí)題鞏固】1.不同的微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要各不相同。下列有關(guān)一種以CO2為唯一碳源的自養(yǎng)微生物營養(yǎng)的描述中，不正確的是()。A氮源物質(zhì)為該微生物提供必要

9、的氮素B碳源物質(zhì)也是該微生物的能源物質(zhì)C無機(jī)鹽是該微生物不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)D水是該微生物的營養(yǎng)要素之一2.如右圖是微生物平板劃線示意圖。劃線的順序為1、2、3、4、5。下列操作方法正確的是( )。A操作前要將接種環(huán)放在火焰旁滅菌B劃線操作須在火焰上進(jìn)行C在5區(qū)域中才可以得到所需菌落D在1、2、3、4、5區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)滅菌3.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是()。A涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212

10、和256，取平均值163D涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值2334.可以鑒定出分解尿素的細(xì)菌的方法是( )。A以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑B以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑C以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入蘇丹試劑D以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入雙縮脲試劑5.通過選擇培養(yǎng)基可以從混雜的微生物群體中分離出所需的微生物。在缺乏氮源的培養(yǎng)基上大部分微生物無法生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌；在培養(yǎng)基中加入10%的酚可以抑制細(xì)菌和霉菌。利用上述方法能從混雜的微生物群體中分別分離出( )。大腸桿菌霉菌放線菌固氮細(xì)菌A B C D6.培養(yǎng)基

11、、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌或消毒方法依次是 ( )化學(xué)消毒灼燒滅菌干熱滅菌紫外線消毒高壓蒸汽滅菌巴氏消毒法A B C D7.下列關(guān)于微生物分離和培養(yǎng)的有關(guān)敘述，錯誤的是（ ）A. 微生物培養(yǎng)前，需對培養(yǎng)基進(jìn)行消毒B. 測定土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)目，常用菌落計數(shù)法C. 分離土壤中不同的微生物，要采用不同的稀釋度D. 分離能分解尿素的細(xì)菌，要以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源8.用平板劃線法或稀釋涂布平板法純化大腸桿菌時（ ）可以用相同的培養(yǎng)基 都需要使用接種針進(jìn)行接種都需要在火焰旁進(jìn)行接種 都可以用來計數(shù)活菌A B C D9. “篩選”是分離和培養(yǎng)生物新類型常用的手段，下列

12、有關(guān)技術(shù)中不能篩選成功的是A在全營養(yǎng)的LB培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基)中，篩選大腸桿菌B在尿素固體培養(yǎng)基中，篩選能夠分解尿素的微生物C用纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基，篩選能分解纖維素的微生物D在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鈉，篩選抗鹽突變體植物10.可以鑒定出分解尿素的細(xì)菌的方法是( )A以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑B以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入二苯胺試劑C以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入蘇丹試劑D以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入雙縮脲試劑11.（2013江蘇卷,18）某研究小組從有機(jī)廢水中分離微生物用于廢水處理。下列敘述正確的是（ ）A. 培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌B. 轉(zhuǎn)換劃線角度后需灼燒接

13、種環(huán)再進(jìn)行劃線C. 接種后的培養(yǎng)皿須放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)D. 培養(yǎng)過程中每隔一周觀察一次12.（2014江蘇30）為了獲得ß-胡蘿卜素產(chǎn)品,某小組開展了產(chǎn)ß-胡蘿卜素酵母的篩選與色素提取實驗。 請回答下列問題:(1)實驗用的培養(yǎng)皿常用的兩種滅菌方法是 ;為了減少滅菌后器皿被污染,滅菌前應(yīng)該 。(2)為了篩選出酵母菌,培養(yǎng)基中添加了青霉素,其目的是 。(3)右圖是滅菌鍋及其局部剖面示意圖,圖中甲、乙、丙指示的依次是 。 (填序號)安全閥、放氣閥、壓力表放氣閥、安全閥、壓力表安全閥、放氣閥、溫度表放氣閥、安全閥、溫度表(4)為了將分離到的菌株純化,挑取了菌落在 3 塊相同平板上

14、劃線,結(jié)果其中一塊平板的各劃線區(qū)均未見菌生長,最可能的原因是 。(5)為增加ß-胡蘿卜素提取量,在研磨酵母細(xì)胞時,添加石英砂的目的是 ;研磨時 (填“需要”或“不需要”)添加 CaCO3,理由是 。13.（2015江蘇31）人工瘤胃模仿了牛羊等反芻動物的胃,可用來發(fā)酵處理秸稈,提高秸稈的營養(yǎng)價值。為了增強(qiáng)發(fā)酵效果,研究人員從牛胃中篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株,并對其降解纖維素能力進(jìn)行了研究。請回答下列問題: (1)在樣品稀釋和涂布平板步驟中,下列選項不需要的是 _ (填序號)。 酒精燈 于培養(yǎng)皿 顯微鏡 無菌水 (2)在涂布平板時,滴加到培養(yǎng)基表面的菌懸液量不宜過多的原因是 。 (3)向試管

15、內(nèi)分裝含瓊脂的培養(yǎng)基時,若試管口粘附有培養(yǎng)基,需要用酒精棉球擦凈的原因是 。 (4)剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物,但并不與纖維素降解產(chǎn)物纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。研究人員在剛果紅培養(yǎng)基平板上,篩到了幾株有透明降解圈的菌落(見右圖)。 圖中降解圈大小與纖維素酶的 有關(guān)。 圖中降解纖維素能力最強(qiáng)的菌株是 (填圖中序號)。 (5)研究人員用篩選到的纖維素酶高產(chǎn)菌株J1和J4,在不同溫度和pH條件下進(jìn)行發(fā)酵, 測得發(fā)酵液中酶活性的結(jié)果見下圖,推測菌株 _ 更適合用于人工瘤胃發(fā)酵,理由是 。 14.尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)肥料，但若不經(jīng)細(xì)菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物種類和數(shù)

16、量繁多，同學(xué)們試圖探究土壤中微生物對尿素是否有分解作用，設(shè)計了以下實驗，并成功篩選到能高效降解尿素的細(xì)菌(目的菌)。培養(yǎng)基成分如下表所示，實驗步驟如圖所示。請分析回答問題：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO4·7H2O0.2 g葡萄糖10 g尿素1 g瓊脂15 g將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL (1)此培養(yǎng)基能否用于植物組織培養(yǎng)？_，理由是_。(2)培養(yǎng)基中加入尿素的目的是篩選_，這種培養(yǎng)基屬于_培養(yǎng)基。(3)“目的菌”生長所需的氮源和碳源分別來自培養(yǎng)基中的_和_，實驗需要振蕩培養(yǎng)，原因是_。(4)轉(zhuǎn)為固體培養(yǎng)時，常采用_的方法接種，獲得單菌落后

17、繼續(xù)篩選。(5)下列材料或用具中：培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿；玻棒、試管、錐形瓶和吸管；實驗操作者的雙手。需要滅菌的是：_；需要消毒的是：_(填序號)。(6)在進(jìn)行分離分解尿素的細(xì)菌的實驗時，A同學(xué)從培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約50個菌落。A同學(xué)的實驗結(jié)果產(chǎn)生的原因可能有_(填序號)。由于土樣不同由于培養(yǎng)基污染由于操作失誤沒有設(shè)置對照(7)簡述土壤中可分解尿素的細(xì)菌的鑒定方法及原理：_微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用【基礎(chǔ)知識】一、微生物的培養(yǎng)1.固體 天然 合成 選擇 青霉素 食鹽 鑒別 伊紅美藍(lán)2.干熱 濕熱（高壓蒸汽） 160 170 100 121 3.平板劃線法 稀釋涂布

18、平板法 稀釋涂布平板法上次 冷卻 第一 劃破 倒置二、2.尿素 選擇3.稀釋涂布平板法5.配置5ml溶液，取0.5ml溶液注入含4.5ml無菌水的試管中，以此類推，最后試管吸取走0.5ml.（或者1:9）一般選取菌落數(shù)為30300的一組計算值比真實值小，因為可能多個個體形成一個菌落6.紅三、3.剛果紅 透明圈 纖維素4.維生素 選擇 鑒別 透明圈 透明圈【習(xí)題鞏固】1. 【答案】B 【解析】以CO2為唯一碳源可知該微生物為自養(yǎng)型微生物，可以利用CO2合成有機(jī)物，該無機(jī)碳源不能為微生物提供能量，其能源來自于光能或分解有機(jī)物釋放出的化學(xué)能。2. 【答案】D【解析】在每次劃線前后都要對接種環(huán)進(jìn)行滅菌

19、，接種環(huán)的滅菌方法是在火焰上灼燒，接種時劃線操作是在火焰旁進(jìn)行。在5個區(qū)域中，只要有單個活細(xì)菌，通過培養(yǎng)即可獲得所需菌落。3. 【答案】D【解析】在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實驗的說服力與準(zhǔn)確性，所以A、B不正確。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，此時，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。4. 【答案】A【解析】在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中，不能分解尿素獲得氮源的細(xì)菌不能生長，而分解尿素的細(xì)菌能利用尿素作氮源，將尿素分解為氨，使pH升高。若培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑將變紅。此培養(yǎng)基既屬于選擇

20、培養(yǎng)基，又屬于鑒別培養(yǎng)基。5. 【答案】A【解析】缺乏氮源的培養(yǎng)基上大部分微生物無法生長，而固氮細(xì)菌能生長；在培養(yǎng)基中加入青霉素可以抑制細(xì)菌和放線菌，霉菌能生長；在培養(yǎng)基中加入10%的酚可以抑制細(xì)菌和霉菌，放線菌能生長。6. 【答案】A【解析】培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿耐高溫，需用干熱滅菌；接種環(huán)可用灼燒滅菌達(dá)到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養(yǎng)成分可采用巴氏消毒法。7. 【答案】A【解析】微生物培養(yǎng)前，需對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，而不是消毒；單個細(xì)菌時肉眼看不見的，肉眼可見的是群落，因此測定土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)目，常用菌

21、落計數(shù)法而一般不用活菌數(shù)計數(shù)；分離土壤中不同的微生物，要采用不同的稀釋度以便能從中選擇出菌落數(shù)在30-300間的平板進(jìn)行計數(shù)；能分解尿素的細(xì)菌，可以利用尿素為氮源，其它微生物不能，故分離能分解尿素的細(xì)菌時，要以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源。8. 【答案】C【解析】平板劃線法或稀釋涂布平板法都使用固體培養(yǎng)基，故正確；平板劃線法采用接種針進(jìn)行操作，而稀釋涂布平板法采用涂布器進(jìn)行操作，故錯誤；純化時，要進(jìn)行無菌操作，需要在火焰旁接種，避免空氣中的微生物混入培養(yǎng)基，故正確；平板劃線法一般用于分離而不是計數(shù)，故錯誤。9. 【答案】A【解析】全營養(yǎng)的LB培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基)上可生長多種細(xì)菌，篩選不到純的大腸桿菌。10. 【答案】A【解析】在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中，不能分解尿素獲得氮源的細(xì)菌不能生長，而分解尿素