氨基酸的分離鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的分離鑒定（紙層析法）氨基酸的分離（紙層析法）一、實(shí)驗(yàn)原理1、層析法又稱色譜法，是一種物理的分離方法。利用混合物屮各組 分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配 系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中，并使各組 分以不同速度移動(dòng)，從而得到有效的分離。操作方式：紙層析、薄層層析、柱層析等分離機(jī)理：分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層 析等2、紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，展層溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上的輕基具有親水性，在濾紙上水就被吸附在 纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)冇機(jī)溶劑（流動(dòng)相）沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析 點(diǎn)時(shí)，層析

2、法上溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配。由于溶質(zhì)就在 水相和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配。由于溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移 動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。分配系數(shù)二溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度物質(zhì)被分離后在濾紙上的移動(dòng)速率用?值表示：?=原點(diǎn)到層析點(diǎn)屮心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離只耍條件（如溫 度、展層溶劑的組成）不變，？?值是常數(shù)，故可根據(jù)?值作定性依據(jù)。氨基酸無(wú)色，利用苗三酮反應(yīng)，可將氨基酸層析點(diǎn)顯色作定性、定量 用。二、實(shí)驗(yàn)器材標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液、濾紙、層析缸、保鮮膜、剪刀、毛細(xì)管、電吹風(fēng)。三、實(shí)驗(yàn)試劑1、酸相溶劑:v正丁醇（a.r） ： v88%甲酸：v水=15： 3： 22、

3、顯色貯備液:v（04mol/l苗三酮異丙醇）:v （甲酸）:v （水）=20： 1： 5四、實(shí)驗(yàn)操作1、點(diǎn)樣量取30ml層析溶劑、iml顯色貯備液于層析缸中，混勻密閉，靜置。戴好手套，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪彩為 18cm*14cmo在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線 上等距離分出幾個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。用毛細(xì)管將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和未知樣品分別點(diǎn)在點(diǎn)樣點(diǎn)上，每次點(diǎn)樣后用 電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干再點(diǎn)下一次，點(diǎn)樣點(diǎn)直徑不超過5mm。2、層析與顯色將濾紙卷成圓筒形，用釘書針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。將濾紙垂直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點(diǎn)樣點(diǎn) 的一端朝下，

4、展層劑液面需低于點(diǎn)樣線lcm左右）。待溶液前沿線距濾紙末端l-2cm （展層長(zhǎng)度10cm,約2h）后，取出 濾紙（需帶上手套），用鉛筆將前沿線作一標(biāo)記。剪去縫合線，電吹風(fēng)熱 風(fēng)吹干（通風(fēng)櫥中進(jìn)行），即可看見層析斑點(diǎn)。3、結(jié)果處理用鉛筆將層析圖譜上的斑點(diǎn)圈出，分別測(cè)量點(diǎn)樣點(diǎn)到層析點(diǎn)中心和點(diǎn) 樣點(diǎn)到層析前沿的距離，計(jì)算各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的rf值，并根據(jù)樣品分離的 情況鑒定混合樣品中氨基酸的組分。五、結(jié)果與討論1層析圖譜苯丙氨酸、脯氨酸和組氨酸。樣品層析圖譜中最下方的斑點(diǎn)難以判斷 是組氨酸還是甘氨酸，結(jié)合rf值和斑點(diǎn)的形狀與顏色,初步判斷是組氨酸。4、本次層析的結(jié)果不好，各標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的rf值與參考值相差

5、較大（偏 ?。?，且樣品的層析方向不垂直，斑點(diǎn)的朝向也不一致。如果僅僅是層析 時(shí)紙筒沒有放平，也不可能出現(xiàn)斑點(diǎn)朝向不一致的現(xiàn)象。將有層析結(jié)果的濾紙放置兩天后，變成了以下情形：圖中顯示，層析溶劑出現(xiàn)了明顯的分層（水相和有機(jī)相），可能是因 為層析缸內(nèi)壁冇較多水，破壞了溶劑的比例。由于正丁醇與水的互溶冇一 定限度，過多的水與有機(jī)相無(wú)法互溶。到層析后期，有機(jī)相大部分到濾紙 上時(shí)，水相開始接觸濾紙并向上移動(dòng)。由于水相的存在切斷了有機(jī)相與下 方溶液的通路，有機(jī)相無(wú)法再向上移動(dòng)，而水相不斷在擴(kuò)大其“勢(shì)力范圍”。 因?yàn)橛袡C(jī)相無(wú)法繼續(xù)上移，有機(jī)相中溶解的氨基酸也無(wú)法隨溶液移動(dòng)，因 此rf值也測(cè)不準(zhǔn)確。由圖可以看出，層析斑點(diǎn)的形狀與水相和有機(jī)相的分界線輪廓匹配, 從而解釋了為何斑點(diǎn)的朝向不一致。因?yàn)榈綄游龊笃?，層析速度慢的氨基?只能停留在水相與有機(jī)相的交界處。5、實(shí)驗(yàn)總結(jié)與改進(jìn)：1）在做紙層析時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格保證展層劑各組分的比例，因?yàn)閞f值與展 層劑的組成密切相關(guān)，且比例不對(duì)時(shí)還可能引起展層劑分層，嚴(yán)重影響實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。2）將紙筒放入層析缸時(shí)一定要小心放平，否則層析方向會(huì)偏，后續(xù) 測(cè)量層析點(diǎn)到原點(diǎn)的距離時(shí)容易產(chǎn)生誤差。3）實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要避免用手直接接觸濾紙，也不要將