海帶表面降油細(xì)菌的分離鑒定及降油性能研究-畜牧漁業(yè)論文

1、海帶表面降油細(xì)菌的分離鑒定及降油性能研究畜牧漁業(yè)論海帶表面降油細(xì)菌的分離鑒走及降油性能研究郭偉成，李作揚(yáng)，王斌，周文君，張凱，常安妮（大連海洋大學(xué)，遼寧省高校海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大 連116023 )摘要:用柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基選擇分離海帶表面具有降解柴油性能的細(xì) 菌；對(duì)分離菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16srdna序列分析并測定其 生長特性；測定了接菌不同濃度（7x107 cfu/ml、7x108 cfu/ml、7x109 cfu/ml ）分離菌對(duì)柴油的降解率;另外，測定了加入不同濃度葡萄糖（0.5 g/l、 1 g/l、2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/

2、l、10 g/l ）作用7 d后分離菌對(duì)柴油的降解率。結(jié)果顯示：從海帶表面分離到2株降油細(xì)菌,編號(hào)為：hd4和hd-6。hd4菌株菌落形態(tài)圓形、直徑1.5 mm.黃色、不透明、邊緣整齊，hd-6®株菌落圓形，直徑1.0 mmz淺黃色、透明、邊緣整齊。兩株菌均為革蘭氏陰性短桿菌。生理生化特征和16srdna序列分析確定hd-4菌株為假交替單胞菌(pseudoalteromonas sp.),其 16srdna 同源性為 99% ; hd-6 菌株為交替 單胞菌（alteromonas_sp.）,其16srdna同源性為98%。2株菌最適生長溫 度均為15 °c。hd-4和hd

3、-6最適生長ph分別為9和&適宜naci濃度分別為2%和4% ;在25 °c振蕩培養(yǎng)（150 r/min ）7 d，接菌量為7x107 cfu/ml.7x108 cfu/ml. 7x109 cfu/ml時(shí)zhd-4對(duì)柴油的初始降解率分別為8 0% , 22.1%和27.6% ; hd-6初始降解率分別為23.7%、38.8%和43 2%o加入葡萄糖后2株菌的降油率均有所增高,加入4 g/l葡萄糖時(shí)達(dá)最高值,3個(gè)接種濃 度下hd-4菌株分別為85.4%、82.3%和80.4% z hd-6菌株分別為86.8%、 93.7%和89.3%。當(dāng)接菌量為7x107 cfu/ml , h

4、d-4在葡萄糖含量為4 g/l時(shí) 作用7 d ,降油率可達(dá)到最大值86.72% , hd-6菌株在葡萄糖濃度6 g/l達(dá)到 最大值67.64%。葡萄糖濃度超過4 g/l和6 g/l時(shí)hd4和hd-6菌株的降油 性能有所下降。關(guān)鍵詞：石油降解菌；海帶；細(xì)菌鑒定；降油性近年來,經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展使得對(duì)能源需求日益增加z而以化石能源為主的能 源結(jié)構(gòu)帶來了海洋石油開采和海上石油運(yùn)輸行業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，而在石油開采、 運(yùn)輸過程中導(dǎo)致的海洋石油類污染隨之成為世界性的問題。根據(jù)國際海事組織的 統(tǒng)計(jì)，全球每年流入海洋的石油數(shù)以千萬噸計(jì)1,特別是在一些海灣,由于其 獨(dú)特的半封閉水域特征，溢油事故一旦發(fā)生就將會(huì)導(dǎo)致可怕

5、的生態(tài)危機(jī)。據(jù) 聯(lián)合國有關(guān)組織統(tǒng)計(jì)z每年由于海上油井井噴事故和油輪事故造成的溢油高達(dá) 220萬t3e如何治理和修復(fù)被石油污染的海洋環(huán)境及被其破壞的生態(tài)系統(tǒng)已經(jīng) 成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。微生物修復(fù)是目前研究最多、應(yīng)用也最為廣泛的一種生物 修復(fù)方法。國內(nèi)外眾多硏究者對(duì)清除石油污染微生物的篩選鑒走、生長特性、菌 株選育、降解原理、降解性能、影響因素等方面進(jìn)行了大量研究4-8o目前有 報(bào)道從耐受石油污染的小型藻類如藍(lán)藻和大型藻類如江籬上篩選降解石油微生 物進(jìn)行研究。radwan9等發(fā)現(xiàn)，大量的石油分解菌附著于多種大型海藻上，這 種藻菌共同作用對(duì)石油類污染物的降解有明顯效果。本硏究通過分離海帶表面的 附著微

6、生物”并從中篩選出具有降油性能的菌株”為制備用于海洋石油污染修復(fù) 的復(fù)合菌劑提供菌種，同時(shí)也為探索以海洋大型藻類為載體強(qiáng)化定植降油細(xì)菌用 于海洋環(huán)境的石油污染修復(fù)奠定基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1樣品來源和培養(yǎng)基海帶樣品采自大連黑石礁潮間帶，菌株初篩選用2216e固體培養(yǎng)基，復(fù)篩選 用柴油平板培養(yǎng)基，測量菌種柴油降解率選用基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基4。柴油平板培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基1000 ml、吐溫80 1 ml、瓊脂粉152 ,121 °cg、0號(hào)柴油10 ml (市售0號(hào)柴油，121弋高壓滅菌后待用),ph 7高壓滅菌20 mino基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：氯化皺0.5 g、氯化鈉20 g、磷酸

7、氫二鉀1 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.1 g、硫酸鐵0.01 g、氯化鈣0.002 g、純水 1 000 ml z ph 7.2 z 121 °c高壓滅菌 20 mino1.2降油細(xì)菌的分離和純化首先將刮取的海帶表皮組織樣品置于5 ml滅菌離心管中，加入2 ml無菌生理鹽水并用勻漿器勻漿，對(duì)勻漿進(jìn)行梯度稀釋(10-1. 10-2. 10-3. 10-4、10-5 ),各取稀釋度為0.1 ml分別涂布于2216e平板上,:于25 °c恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)分別挑取單菌落于2216e平板進(jìn)行純化”每株菌分別純化三代后將其保種于2216e斜

8、面用于初篩降油菌株，同時(shí)接種2216e液體25 °c培養(yǎng)24 h z加入50% (v/v )滅菌甘油置于-80 °c保存。將分離純化的菌 株分別吸取10 pl點(diǎn)種到柴油平板中,25 °c恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 72 h。待平板 上長出較清晰菌苔,挑取生長狀況良好的菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3菌落及菌體的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒走將純化后并在柴油平板上生長良好的目標(biāo)菌株分別在2216e平板上進(jìn)行平 板劃線，置于25艾培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)并挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡 檢。按照魚類及其他水生動(dòng)物細(xì)菌實(shí)用鑒定指南10和常見細(xì)菌鑒定手 冊11鑒走其生理生化特性。1.4

9、16s rdna基因測序及序列的擴(kuò)增將待測菌株送至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行16srdna基因測序及擴(kuò)增， 將測序結(jié)果輸入genbank數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行blast(basic local alignment search tool)同源性比對(duì)。1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建利用mega5.05軟件，將所得16srdna序列，進(jìn)行多序列比對(duì)同時(shí)計(jì)算序 列間的系統(tǒng)進(jìn)化距離,用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后，以自舉數(shù)為1 000 ,通過自引導(dǎo)法(bootstrap)進(jìn)行置信度的檢測。1.6石油降解細(xì)菌的生長特性161溫度將目標(biāo)菌株用2216e液體培養(yǎng)基活化24 h后接

10、種到5ml2216e液體培養(yǎng)基中，以不同的溫度梯度(5 °c、10 °c、15 °c 20 °c、25 °c 30 °c.35 °c、40 °c)培養(yǎng)24 h ,每三個(gè)平行為一組。對(duì)照組為未接菌的培養(yǎng)基,以 波長為600 nm ,采用分光光度法測量實(shí)驗(yàn)組的吸光值(od600nm)。以培養(yǎng)溫 度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)作圖，得到不同溫度條件下石油降解菌的生長特性。1.6.2ph將目標(biāo)菌株用2216e液體培養(yǎng)基活化24 h后，接種到5 ml 2%naci牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，以不同的ph梯度(ph二5、6、7、&a

11、mp; 9、 10z naci濃度2%)25 °c培養(yǎng)24 h ,每三個(gè)平行為一組。對(duì)照組為未接菌的培 養(yǎng)基，以波長為600 nm ,采用分光光度法測量實(shí)驗(yàn)組的吸光值(od600nm)。 以培養(yǎng)ph為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，得到不同ph條件下石油降解菌的 生長特性。163鹽度將目標(biāo)菌株用2216e液體培養(yǎng)基活化24 h后，接種到5 ml牛肉膏蛋白月東液體培養(yǎng)基中，以不同鹽度(naci濃度分別為1%、2%、3%. 4%、 5%)25弋培養(yǎng)24 h ,每組三個(gè)平行。每三個(gè)平行為一組。對(duì)照組為未接菌的培養(yǎng)基，以波長為600 nm ,采用分光光度法測量實(shí)驗(yàn)組的吸光值(od600nm)。以

12、培養(yǎng)naci濃度為橫坐標(biāo)”吸光值為縱坐標(biāo)作圖”得到不同naci濃度條件下 石油降解菌的生長特性。1.7細(xì)菌降油性能測定酉己置mmc液體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌鍋中121 °cz o.impa滅菌20 mino將在2216e斜面培養(yǎng)24 h處于對(duì)數(shù)生長期的菌斜面用無菌生理鹽水洗脫，梯度稀釋并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，選擇細(xì)菌數(shù)為7x107 cfu/ml. 7x108 cfu/ml、 7x109 cfu/ml 的梯度。接種：分別將0.1 ml無菌柴油和1 ml濃度為7x107 cfu/ml. 7x108 cfu/ml. 7x109 cfu/ml的菌懸液依次加入到mmc培養(yǎng)基中，每種接菌量設(shè)置三組平行

13、實(shí)驗(yàn)，以不接種菌液的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將接種好的三角燒瓶置于25 °c z 150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 do柴油降解率的測定：將搖好的錐形瓶水平平穩(wěn)取出，分別加入適量無水硫酸鈉,蓋上棉塞,輕輕搖動(dòng)使無水硫酸鈉盡量溶解。吸取20 ml石油醛(透光 率 90% ,沸程60 90 °c )加入三角瓶中，放回?fù)u床搖10 min后取岀錐形瓶, 用移液槍吸取500 ml上層石油瞇，加入到25 ml的比色管中z用石油醛定容 至25 ml ,充分混勻。在221 nm波長處通過紫外分光光度計(jì)測走各組吸光值。根據(jù)以下公式計(jì)算出降解率。降解率(d)=(ao-ai ) /ao x 100%，

14、其中 d 為柴油降解率z a0為空白對(duì)照組柴油吸光值，ai為實(shí)驗(yàn)組剩余柴油吸光值。1.8測定葡萄糖對(duì)石油降解菌降油率的影響以葡萄糖終濃度為4 g/l的mmc培養(yǎng)基，分別按3個(gè)濃度接種(7x107 cfu/ml、7x108 cfu/ml. 7x109 cfu/ml )兩株實(shí)驗(yàn)菌，每種接菌量設(shè)置三組 平行實(shí)驗(yàn)，不接種菌液的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，將接種好的三角燒瓶置于25 °c , 150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d。同法測走柴j由降解率，比較不同接種量對(duì)柴油降 解率的影響。1.9不同葡萄糖濃度對(duì)石油降解菌降油率的影響配制不同葡萄糖濃度(0.5 g/l、1 g/l、2 g/l、4 g/l、6

15、 g/l、8 g/l、10 g/l ) 的柴油培養(yǎng)基,分別接種兩株實(shí)驗(yàn)菌(107 cfu/ml ) z 25 °c、150 r/min恒溫 搖床分別培養(yǎng)7 d ,測走柴油降解率。2結(jié)果2.1石油降解菌的初篩經(jīng)柴油平板初篩得到2株不同形態(tài)的細(xì)菌，分別編號(hào)為：hd4、hd-6o兩 株菌可在以柴油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。在2216e平板上25 °c 24 h后，hd-4菌落形態(tài)特征為圓形、偏黃、不透明、邊緣整齊、= 1.5 mm z有運(yùn)動(dòng)能力。hd-6菌落形態(tài)特征為圓形、微黃，邊緣整齊、無圓心、二1.0 mm.有運(yùn)動(dòng)能力，培養(yǎng)24 h時(shí)菌落透明z 48 h后菌落變得不透明。兩株

16、菌均為革蘭氏陰性桿菌，見圖1和圖2。圖1 hd-4帝株的鏡下和菌落形態(tài)圖2 hd-6 株的鏡下和菌落形態(tài)2.2hd-4和hd-6菌株生理生化特征hd-4是假單胞菌屬，革蘭氏染色陰性無芽抱桿菌，呈桿狀或略彎，菌體大小(051"(1.54)呵。具端鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，不發(fā)酵糖類。hd-6是交替單胞 菌屬：直或彎的桿狀，(0.7 1.5 ) pmx (1.8 -3.0 ) pm ,不積累聚卩輕基丁酸鹽顆粒(phb)作為胞內(nèi)貯存物，不形成微胞囊和芽抱，細(xì)胞染色革蘭氏陰性。大多數(shù)以單個(gè)無鞘和極生鞭毛運(yùn)動(dòng)z有帶鞘的鞭毛?；墚愷B(yǎng)菌，能呼吸而不發(fā) 酵的代謝型。精氨酸雙水解酶陰性,所有的都耐鹽生長，具體生

17、理生化特征見表lo鑒定指標(biāo)hd-4hd-6運(yùn)動(dòng)性+氣化酶+接觸+明膠水解+精氨酸雙水解16萄糖氧化十+舫萄糖發(fā)酵v-p試臉吟嗓試驗(yàn)+甲基紅試驗(yàn)檸棕酸鹽試驗(yàn)硝酸鹽還原()/129藥敏紙片敏感性注：一反應(yīng)陰性$+反應(yīng)陽性皿不確定2.316s rdna序列及系統(tǒng)發(fā)育樹231基因序列同源性比對(duì)將純化后得到的hd4、hd-6菌株的單菌落移送 至大連寶生物公司進(jìn)行16s rdna片段的擴(kuò)增z對(duì)擴(kuò)增得到的16s rdna序列 進(jìn)行測序，將hd-4、hd-6菌株的16s rdna序列測序結(jié)果與國際互聯(lián)網(wǎng)ncbi 上 genbank 中數(shù)據(jù)進(jìn)行 blast 比對(duì) z 發(fā)現(xiàn) hd-4 與 pseudoaltero

18、monas sp. 同源性達(dá)到99% ; hd-6菌株16srdna序列與alteromonas sp同源性98%e2.3.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹序列的比對(duì)結(jié)果，利用mega5.05軟件進(jìn)行多序列比 對(duì)同時(shí)計(jì)算序列間的系統(tǒng)進(jìn)化距離，構(gòu)建的發(fā)育樹得出：hd-4與 pseudoalteromonas sp. cf4-10 聚為一支;hd-6 與 alteromonas sp. hb1 聚為一支，如圖3opstudoatnnoiats sp re1bfs pwutoale<tw» ipotytica mv» tcb psev«wt*fvnonmjf®nu (m

19、mvngnaip ms23w.unuim up sh7ajthomcmftfi mximdirhd5we<orr<y5.mbl1 0005 *苗i圖3hd-4.hd-6系統(tǒng)發(fā)育樹2.4細(xì)菌生長特性的測定圖4-圖6表明，hd-4和hd6菌株最適生長溫度分別為15 °c和20 °c ,兩菌株在1030 °c范圍內(nèi)能較好生長”說明兩株能適應(yīng)較大的溫度范圍且具有一定的耐低溫能力。兩株菌最適生長naci濃度分別為2%和4% ;最適生長 ph分別為9和8 ;且兩菌株在naci濃度1% 5%、ph = 5 9范圍內(nèi)，生長 情況良好，說明兩菌株生長能力較強(qiáng)，對(duì)于不同鹽

20、度、不同ph有一定的耐受性。圖4兩株苗的屢適生長混度na.cl/%2 8 6421emiki2o hl i lqooq o o o o o o o a35aoowloe去至兩株菌的火適生長naci4- 6 whd圖6兩株菌的殂適生長ph2.5hd-4和hd6菌株原始降解率的測定hd-4和hd6菌株初始柴油降解率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著接兩株菌的降解率均呈現(xiàn)上升趨勢,hd-4菌株接菌量為107 cfu/ml降解率只有8.0% ;當(dāng)接菌量達(dá)到108 cfu/ml和109 cfu/ml時(shí)降解率有所提升，分別達(dá)到22 1%和27.6%。hd-6菌株接菌量為107 cfu/ml降解率為23.7% ,而接菌量為

21、108 cfu/ml和109 cfu/ml時(shí)，其降解率分別達(dá)到了 38 8%和43.2% ,兩株菌對(duì)柴油的降解率都與菌濃度正相關(guān)，且兩株菌差異性計(jì)算結(jié)果均顯示當(dāng)接顯著（pv0.05）,接菌量為107 cfu/ml時(shí),柴油降解率與108 cfu/ml、109 cfu/ml降解率差異量在108 cfu/ml和109 cfu/ml時(shí)降解率差異不顯著(p>0.05),詳見圖 7o100.01 him80.0% 60. m40. k20.010.0%10*710*810*9接詢晝/“l(fā)h mlzr圖7 hd-4和hd-6菌株初始柴油降解率2.6加入葡萄糖對(duì)柴油降解率的影響n hd 4無糖 e3hd

22、7含猶圖8添加葡萄糖對(duì)hd-4柴油降解率額影響 hd-6無瑚 hd圖9潘加葡萄楫對(duì)hd-6柴油降解率額影響在以柴油為唯一碳源的mmc培養(yǎng)基中加入終濃度為4 g/l的葡萄糖后，不同接菌量實(shí)驗(yàn)組對(duì)柴油降解率都有大幅度提升,均達(dá)到80%以上,且接菌量為107cells/ml時(shí)hd4菌株和hd6菌株的柴油降解率分別可達(dá)到85.4%和86.8% ,不同接菌量兩株菌對(duì)柴油的降解率差異不顯著(p > 0.05 x而在終濃度為4 g/l的葡萄糖的條件下相同接菌量兩菌株的柴油降解率會(huì)因葡萄糖的增加而顯著增大，差異極顯著(p<0 01)，且在菌濃度為107cells/ml時(shí)即可達(dá)到很高的降解率。詳見圖

23、&圖9。2.7不同濃度葡萄糖對(duì)菌株降油性能的影響在接菌量為107 cfu/ml的條件下，添加不同濃度葡萄糖，hd-4和hd6兩株菌對(duì)柴油的降解率隨著葡萄糖濃度的增加都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,hd-4 在葡萄糖濃度為 1 g/l、2 g/l、4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l 時(shí)能保持 較高的降解率，且在葡萄糖濃度為4 g/l時(shí)達(dá)到最大值86.72% ;而hd6在空 萄糖濃度為4 g/l、6 g/l、8 g/l、10 g/l濃度時(shí)對(duì)柴油的降解率才達(dá)到比較高的水平，在葡萄糖濃度為6 g/l時(shí)達(dá)到最大值67.64% ,見圖10。圖10不同濃度葡萄蹶對(duì)兩株菌降油性能影響3討論通過

24、以柴油為唯一碳源的柴油平板培養(yǎng)基，初篩得到兩株能利用柴油生長的菌株，編號(hào)為hd-4、hd-6，經(jīng)鑒定分別屬于假交替單胞菌屬和交替單胞菌屬。兩株菌均可耐鹽生長，對(duì)柴油具有降解能力，其原始降解率與菌種接入量呈正相 關(guān)。有關(guān)藻類附著微生物石油污染物的利用性研究目前有關(guān)報(bào)道較少，s.s.radwan等2002年報(bào)道在阿拉伯灣海域的幾種大型藻類;滸苔enteromorpha. 馬尾藻sargassum.石花菜gelidium.江wgracilaria等)表面附著多種可利 用石油類物質(zhì)的微生物，以放線菌(actinomycetes)和不動(dòng)桿菌(acinetobacter) 為主,其中約64% 98%可利用

25、烷繪，約38% 56%可利用芳香繪(菲)12。 并且這些微生物是定植在藻類的表面，不易脫落，很可能與藻類屬于共生關(guān)系。 本研究分離的兩株降油細(xì)菌是否為海帶附著微生物中的優(yōu)勢種類,以及與海帶的 生態(tài)關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。hd-4和hd6兩株菌在添加葡萄糖后對(duì)柴油的降解率大大提高，在7 d內(nèi)可達(dá)到80%以上,并且菌種的接入量對(duì)降解率影響不明顯。葡萄糖為微生物代謝的初級(jí)能源，添加少量的初級(jí)能源物質(zhì)，促進(jìn)微生物對(duì)某些特殊物質(zhì)的代謝稱 為共代謝 13,它具有縮短生物處理系統(tǒng)適應(yīng)和繁殖期的優(yōu)勢14。微生物共代謝是時(shí)下研究較多的領(lǐng)域并具有較大的應(yīng)用空間，在很多污染地方，如廢污 水治理、土壤修復(fù)等領(lǐng)域有著廣

26、泛應(yīng)用,且對(duì)一些難降解的有機(jī)污染物”生物降 解有其特殊優(yōu)勢15j刀。有學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖作為外加碳源加入土 壤后，可以提高原土壤中有機(jī)碳的礦化速率18 z推測其機(jī)理可能正是由這種微 生物共生作用增強(qiáng)了微生物的活性,增強(qiáng)了微生物的數(shù)量并且提高了其酶活力19-20。但是在測定添加不同濃度葡萄糖后兩株菌的降油率實(shí)驗(yàn)中hd6菌株的降解率較之前出現(xiàn)了下降的情況，分析原因考慮是否為轉(zhuǎn)接過程中代謝能力受到一定影響。鑒于實(shí)驗(yàn)菌株的降油機(jī)理還不太清楚,其降解酶類的表達(dá)情況、影在柴油利用過程中是響因素等還需進(jìn)行深入的研究。另外，本硏究采用的兩株 否具有共代謝作用也是今后需要深入研究的問題，這對(duì)利用這兩株菌

27、進(jìn)行石 油污染海域或其他環(huán)境的生物修復(fù)具有重要的意義。參考文獻(xiàn): 支振鋒.油輪泄漏與海洋生物災(zāi)難幾新安全，2004 ( 6 ): 60-642 陳鋒，陳偉琪，王萱溢油事故造成的海灣生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)損失的貨幣化評(píng) 估j環(huán)境科學(xué)與管理.2009 ,34(11): 1-53 united nations environment programme.keeping track of our changing environment: from rio to rio+20 (1992-2012)r.nairobi : united nations environment programme z 2011 :

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