免疫熒光技術的臨床應用

1、 免疫熒光技術臨床的應用天水市第一人民醫(yī)院檢驗科 李杰 隨著人們生活水平和意識的不斷提高，各種因素的影響，近年來每31個人中就有一個人在受到自身免疫性疾病的折磨，臨床表現(xiàn)復雜，不易早期發(fā)現(xiàn)。 自身免疫性疾病涉及多學科（風濕免疫科、內分泌科、血液科、婦產科、皮膚科、腎病科、消化科等等） 自身免疫性疾病涉及多病種(混合結締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、磷脂綜合癥、原發(fā)性系統(tǒng)性血管炎、韋格納肉芽腫、壞死性新月體腎小球腎炎、顯微多動脈炎、習慣性流產、干燥綜合征、皮肌炎、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性膽管炎等等） 自身免疫性疾病的共同特征： 患者血清中有多種自身抗體或自身反應性致敏淋巴細胞存在，患者組織器

2、官的病理特征為免疫炎癥，用相同抗原在某些動物實驗中可復制出相似的疾病模型，多數(shù)病因不明，疾病有重疊現(xiàn)象，即一個病人可同時患一種以上自身免疫病，病程一般較長，多遷延為慢性，有遺傳傾向。 鑒于自身免疫性疾病的共同特征，通過檢測自身抗體可以有效準確的診斷自身免疫性疾病，為臨床提供高效準確的診斷依據(jù)。 自身抗體檢測的開展，不僅讓我院在自身免疫性疾病診斷治療上有很大的提高，還可為隴東南地區(qū)400萬人口提供更準確、更專業(yè)的自身免疫性疾病診斷服務。節(jié)省患者去外院檢測診斷所花費的時間和費用，使我院在整個地區(qū)具有一定的影響力，也會為醫(yī)院帶來可觀的經濟效益。鑒于此，我院完全有必要應用間接免疫熒光技術開展自身抗體項

3、目的檢測。2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 1間接免疫熒光法（IFA Indirect Fluorescent Assay ）3免疫印跡法（IB）WesternblotLIA4其它：IDA、RIA等 間接免疫熒光法實驗原理細胞、組織切片或純化的、生化性質明確的物質均可作為檢測自身抗體或病原體抗體的抗原基質。如標本為陽性，已稀釋血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結合。第二步，已結合的抗體與熒光素標記的抗人抗體結合，然后在熒光顯微鏡下觀察結果。陽性標本經系列稀釋后可測出其滴度。最適稀釋因子為3.162（10的平方根），這樣，每隔一步就出現(xiàn)一個10的整數(shù)倍數(shù)（1:10、1:32、1:100、1:

4、320、1:1000、 1:3200, 1:10000等 間接免疫熒光法檢測的特點 特異性高：陽性與陰性標本的熒光強度差別明顯。每種已結合的抗體在相應抗原的位置產生典型的熒光模型。 基質中抗原譜完整，可檢測多種抗體，并且檢出率高。 可在一種生物基質上同時檢測多種抗不同生化特性抗原的抗體。 當酶免試劑所需要的抗原難以制備或無法獲得時，可選擇間接免疫熒光法。 自身抗體檢測的標準和最經典的實驗方法是間接免疫熒光檢測法（IFA)。 需要熒光顯微鏡。 操作者需要一定的專業(yè)知識。 操作者需要一定的工作經驗。顯微鏡下的結果判斷為綜合知識的體現(xiàn)，到目前為止，尚沒有任何儀器可取代人工讀片。 國內現(xiàn)狀自身抗體的測

5、定不普遍自身抗體的測定不普遍欠規(guī)范欠規(guī)范對其意義了解尚少對其意義了解尚少缺乏研究缺乏研究 自身抗體種類繁多 常見自身抗體： 抗核抗體譜(ANAS)檢測 抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）檢測 類風濕因子和抗CCP抗體 自身免疫性肝病相關自身抗體檢測Tankertanker Design 檢驗科 擬開展自身抗體檢測項目介紹及相關自身免疫性疾病 檢驗項目檢驗項目 試劑價格試劑價格收費標準收費標準抗核抗體抗核抗體 （ANA）18.918.943.843.8ANAANA譜譜3180180329.6329.6雙鏈雙鏈DNA222219.519.5角蛋白抗體（角蛋白抗體（AKA）29.529.519.519

6、.5環(huán)瓜氨酸肽（環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體）抗體393978.278.2肝抗原譜肝抗原譜9項項176176221.4221.4蛋白酶蛋白酶3 （PR3）、髓過氧化物酶）、髓過氧化物酶（MPO）、腎小球腎炎）、腎小球腎炎7878146.4146.4抗中性粒細胞漿抗體抗中性粒細胞漿抗體383897.697.6過敏原特應性組合過敏原特應性組合300300438438 抗核抗體（ANA）u 定義以細胞核內物質為抗原的抗體ANA可見于多種疾病，特別是結締組織疾病，常作為結締組織病的診斷、病 情判斷和療效觀察的指標（SLE的篩查抗體）。在非結締組織?。ǜ腥?、慢肝、肺纖維化或腫瘤）中也可出現(xiàn)陽性。正常人中（特

7、別是老年人）也可出現(xiàn)陽性，但滴度低，并且常表現(xiàn)為IgM型。高滴度ANA則高度提示自身免疫性疾病。目前，ANA檢測已成為臨床上的一個極重要的自身免疫病的篩查實驗。抗核抗體（抗核抗體（ANAANA）系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期95100%非活動期80100%藥物誘導的紅斑狼瘡100%混合性結締組織?。∕CTD、Sharp綜合征）100%類風濕性關節(jié)炎2040%進行性系統(tǒng)性硬化癥2050%多發(fā)性肌炎及皮肌炎8595%干燥綜合征3050%慢性活動性肝炎7080%潰瘍性結腸炎3040%其它風濕病26%正常人5-10%抗核抗體（抗核抗體（ANAANA）u方法間接免疫熒光法u結果判斷: 滴度1：100為陽性 常見核

8、型5種 不同核型的臨床意義不同ANA常見五種核型及臨床意義u核膜型與抗ds-DNA有關， 多見于SLE，特別是有腎炎者u均質型與AHA、抗DNA有關，引起LE形成 主要見于SLE、藥物性狼瘡u斑點型與抗ENA有關，應進一步查特異性抗體u核仁型多見于硬皮病u著絲點型多見于CREST綜合征 核膜型核膜型 與抗與抗ds-DNA有關，有關， 多見于多見于SLE，特別是有腎炎者，特別是有腎炎者 均質型均質型與與AHAAHA（抗組蛋白抗體（抗組蛋白抗體）、抗、抗DNADNA有關，有關，引起引起LELE形成主要見于形成主要見于SLESLE、藥物性狼瘡、藥物性狼瘡 斑點型斑點型 與抗與抗ENA有關，應進一步查

9、特異性抗體有關，應進一步查特異性抗體核仁型核仁型多見于硬皮病多見于硬皮病 著絲點型著絲點型多見于多見于CREST綜合征綜合征 抗核抗體譜（ANAs） 項目包含nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白、AMA M2，共15項?？箍筺RNPnRNP抗體抗體：高滴度的抗U1-nRNP抗體是混合性結締組織（MCTD，夏普綜合征）的標志，陽性率為95-100%，抗體滴度與疾病活動性相關，在30-40%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中也可檢出抗U1-nRNP抗體，但幾乎總伴有Sm抗體?？箍筍mSm抗體

10、抗體： 抗Sm抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性抗體，與抗dsDNA抗體一起，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷指標，但陽性率僅為5-10%?？箍筊o-52Ro-52抗體抗體：與其它抗體（如：SS-A）同時出現(xiàn)時則高度提示（SS-A）的相關疾病?？箍筍cl-70Scl-70抗體抗體：見于25-75%的進行性系統(tǒng)性硬化癥（彌散型）患者中，因實驗方法和疾病活動性而異（Scl=硬化癥），在局限型硬化癥患者中未檢出該抗體。 抗核抗體譜（ANAs）抗抗SS-ASS-A抗體：抗體：與各類自身免疫性疾病相關，最常見于干燥綜合征（40-80%）、也見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（30-40%）和原發(fā)性膽汁性肝硬化（20%）中，偶見于慢性活

11、動性肝炎。此處，在100%的新生兒紅斑狼瘡中抗SS-A抗體陽性。該抗體可經胎盤傳給胎兒引起炎癥反應和新生兒先天性心臟傳導阻滯?？箍筍S-BSS-B抗體抗體：幾乎僅見于干燥綜合征（40-80%）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（10-20%）的女性患者中，男女比例為1：29。在干燥綜合征中SS-A抗體和抗SS-B抗體常同時出現(xiàn)?？笿o-1抗體：見于多肌炎、陽性率為25-30%。常與合并肺間質纖維化相關?？怪z點抗體（抗著絲點抗體（CENP BCENP B）：與局限型進行性系統(tǒng)性硬化癥（CREST綜合征：鈣質沉著、Raynaud病、食管功能障礙、指硬皮病、遠端血管擴張）有關，陽性率為70-90%。在原發(fā)性膽汁性肝

12、硬化患者中也可檢測到該抗體（陽性率為10-30%。還可出現(xiàn)于雷諾氏綜合征中?？购丝贵w譜（ANAs）抗抗dsDNAdsDNA抗體抗體：對系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有很高的特異性。除抗Sm抗體外，抗dsDNA抗體也可做為該病的一個血清學標志，陽性率40-90%，且與疾病的活動度相關，可用于療效監(jiān)測?？购诵◇w抗體抗核小體抗體：系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的陽性率為50-95%，特異性幾乎為100%。核小體是細胞染鈀體的功能亞單位，由DNA和組蛋白以特殊的且成。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期抗核小體抗體比抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體更早出現(xiàn)，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的誘因和致病有重要作用。組蛋白抗體：組蛋白抗體：一種或幾種組蛋白

13、抗體或抗H2A-H2B復合物抗體在藥物（普魯卡因胺、肼酞嗪以及其它藥物）誘導的藥斑狼瘡中比較常見（陽性率95%）。另外，在30-70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡和15-50%的類風濕性關節(jié)炎患者中也可檢出抗組蛋白抗體。抗核糖體抗核糖體P P蛋白抗體蛋白抗體：是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性標志，陽性率為5-15%。普遍認為ARPA的滴度與SLE的活動性相關，還與SLE的中樞神經系統(tǒng)癥狀、腎臟或肝臟受累相關?？筪s-DNA抗體u臨床意義臨床意義 對對SLESLE的診斷有較高特異性的診斷有較高特異性 滴度與滴度與SLESLE活動相關，可作為病情監(jiān)測及療效觀察指標活動相關，可作為病情監(jiān)測及療效觀察指標 與與SLESL

14、E腎損害有關腎損害有關u檢測方法檢測方法 放免法（放免法（Farr)Farr)敏感，有利于早期預測敏感，有利于早期預測 檢測高親合力的抗檢測高親合力的抗dsds-DNA-DNA 間接免疫熒光法間接免疫熒光法(IF)(IF)特異特異 ELISAELISA可檢測低親合力的抗可檢測低親合力的抗dsds-DNA-DNA 有助于中樞狼瘡的病情監(jiān)測有助于中樞狼瘡的病情監(jiān)測 金標免疫斑點法金標免疫斑點法抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP）u瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋白相關 抗體的主要抗原決定簇u對RA診斷具有高度特異性（98%）u可在RA早期出現(xiàn)u預測早期關節(jié)炎發(fā)展為RAuRA關節(jié)侵蝕破壞的早期識別及預測我科

15、開展的自身免疫肝炎系列抗體包括：我科開展的自身免疫肝炎系列抗體包括：抗肝細胞膜抗體(抗LMA)抗肝腎微粒體抗體（抗LKM抗體）抗肝-胰抗體(抗LPLP抗體)抗可溶性肝細胞抗體（抗SLA）抗線粒體抗體（AMA）肝抗原譜肝抗原譜9 9項項SLA/LP：抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體；是AIH的最特異診斷指標，陽性率10-30%，特異性100%。RO-52：不具有疾病特異性AIHAIH其他診斷指標其他診斷指標：1）ANA30-40%；2）ASMA抗平滑肌抗體（F-肌動蛋白）40-90%3）肝細胞膜抗原抗體35%4）去唾液酸糖蛋白受體80-90%PBCPBC其他診斷指標：其他診斷指標：1）AMA-M4

16、55%2）AMA-M8 55%3）AMAM9 35-85%4）核點30 %PSCPSC（原發(fā)性硬化性膽管炎）（原發(fā)性硬化性膽管炎）：在PSC中最常見的自身抗體為PANCA（陽性率為70-80%）重疊綜合征重疊綜合征（主要發(fā)生于自免性肝病之間）( (一一) )類風濕關節(jié)炎（類風濕關節(jié)炎（RARA）u類風濕因子（RF）u早期診斷的系列指標 抗RA33/36抗體 抗核周因子（APF） 抗角蛋白抗體（AKA） 抗Sa抗體 抗環(huán)瓜氨酸抗體（抗CCP）(二)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）u是一種臨床表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害癥狀的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其血清有以抗核抗體為主的大量不同的自身抗體u自身抗體（1）抗核抗體

17、譜ANA、抗ds-DNA、抗ENA抗體（2）抗磷脂抗體（3）抗組織細胞抗體抗RBC抗體 抗血小板相關抗體 抗神經元抗體（4）其它RF、p-ANCA(三)皮肌炎/多發(fā)性肌炎（PM/DM）u免疫學檢查 ANA ENA抗Jo-1陽性u其它檢查肌酶譜 肌酸磷酸激酶（CPK）: MM-心肌和骨骼肌 MB-心肌 BB-平滑肌和腦內 乳酸脫氫酶（LDH） 谷草轉氨酶（AST） 谷丙轉氨酶（ALT） 堿性磷酸酶（ALP）(四)干燥綜合征（SS）uANA陽性率40%70%uENA抗SSA抗體陽性率70%96% 抗SSB抗體陽性率50%87%u抗-Fordrin對于pSS或sSS的診斷有一 定意義，但特異性和敏感性并不理想。uRF陽性率75%100%u高球蛋白血癥uWBC下降(五)系統(tǒng)性硬化病（pSS）uANA陽性率50%55%uENA抗Scl-70陽性率15%40%u抗著絲點抗體(ACA)陽性(六)混合性結締組織?。∕CTD）uANA陽性uENA抗RNP高滴度陽性（七）血管炎（七）血管炎 抗中性粒細胞胞漿抗體（抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCAANCA）熒光圖譜分型主要抗原成分胞漿型cANCA核周型pANCA蛋白酶3（PR3）髓過氧化物酶（MPO）非典型型（cANCA）不清ANCA的臨床意義uc-ANCA和PR3-ANCA 對韋格納肉芽腫有高度特異性（95%），敏感