基因克隆步驟

1、1總RNA提取(1)液氮研磨或冰上勻漿實(shí)驗(yàn)材料；先將 1ml Trizol加到離心管中待用(2)將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5 min；打開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷(3)加200小氟仿，振蕩15 sec;室溫放置3 min,分層；(4) 4oC, 12,000g,離心 15 min；(5)取上清，加500以異丙醇，混勻，室溫放置10 min；(6) 4oC, 12,000g,離心 10 min；(7)棄上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙醇清洗(8) 40C, 7,500g,離心 5 min；(9)棄上清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺(tái)里干燥后，加50 L DE

2、PC 水，80oC保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過(guò)DEPC滅活RNA酶處理。提取的總 RNA需經(jīng)RNA電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。OD260值為核酸的吸收值，OD280值為蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0問(wèn)一般說(shuō)明該核酸蛋白含 量在允許的范圍內(nèi)，可正常使用；此外還有OD230值為多糖和酚類的吸收值，比較干凈的核酸OD260/230值能達(dá)到2.2左右。RNA濃度計(jì)算公式：總 RNA濃度(n g/mL =A260>#釋倍數(shù) >4002反轉(zhuǎn)錄/cDNA第一鏈的合成純化RNA以去除基因組 DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT rea

3、gent with gDNA Eraser（Perfect Real Time說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其體系為：Total RNA1 g5X gDNA Eraser Buffer21gDNA Eraser1 LRNase Free dHO補(bǔ)齊至 101條件為：42oC, 2min;RNA純化后，即可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。其體系為：5 x PrimeScript Buffer 2( for Real Time)4 仙 LPrimeScript RT enzyme mixI1 仙 LRT Primer Mix1L上一步的反應(yīng)液10nLRNase Free dH2O補(bǔ)齊至 20 a L操作條件為：(1) 37oC 放置

4、15 min; (2) 85oC, 5 sec； (3) 4oC 保存3 PCR按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，PCR反應(yīng)體系如下:Premix Taq25仙 L模板5L引物 1 (10nM)1引物 2 (10nM)1ddH2O18MPCR反應(yīng)條件為：94° C預(yù)變性5min； 94° C變性30s, 53° C退火30s, 72° C 延伸30s,循環(huán)36次；72° C延伸10min。PCR反應(yīng)完畢，取5L反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用 10仙L反應(yīng)產(chǎn)物）4基因克隆及測(cè)序1.1 PCR產(chǎn)物

5、切膠回收將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察并切下預(yù)期大小的 DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割膠回收試劑 盒進(jìn)行純化，步驟如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱 CB2中(吸附柱放入收集管中)加入 5001平衡 液BL, 13,400X g離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集 管中；(2)按 100 mg agarose膠力口入 100 l L溶液 PC,置于 50oC 中 10 min 左右， 中途混勻幾次，至膠完全融化；(3)將樣品倒入一個(gè)吸附柱 CB2中(吸附柱放入收集管中),室溫下13

6、,400 xg離心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600仙L漂洗液PW (加乙醇)，室溫下13,400Xg離 心1 min,倒掉收集管中的廢液，吸附柱 CB2重新套回收集管中；(5)重復(fù)上一步驟；(6)將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400X g離心2 min,盡量除去 漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7)將柱子套入一新的滅菌1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 50L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400X g室溫離心2 min,收集到的洗脫 液即為回收的DNA純化液；(8)取5L的純化液體進(jìn)行1%

7、瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測(cè)量溶液 中DNA含量。1.2 目的片段與載體連接(1)膠回收產(chǎn)物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試劑 盒說(shuō)明書(shū)。在滅菌的0.5 mL離心管中配制如下溶液(10小，：回收DNALigation Solution pMD18-T Vector(2) 16oC反應(yīng)30分鐘，所得產(chǎn)物保存于4oC冰箱備用1.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5 a(1)將5小旌接產(chǎn)物加入到100仙E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)離 心管混勻內(nèi)容物，冰上靜置 30 min；(2) 42oC水浴熱激轉(zhuǎn)化90 sec，立即放回冰上，放置3 min；(3)每管加入500仙LLB培養(yǎng)基(室溫放置)，37oC 160-180 rpm振蕩培養(yǎng) 45-60 min,使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；(4)在含有Amp (100仙g/mL的選擇性平板上加入60-100仙L菌液，用無(wú) 菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用 Parafilm膜封好；(5)將培養(yǎng)皿正放，37oC約50 min,待液體全部吸收后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)10-16 h04.4轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定(1)用無(wú)菌槍頭挑取LB平板上3-5個(gè)單菌落，分別接種到3.5 mL LB液體 培養(yǎng)基中(含 100 Ng/mL Amp, 3