血管平滑肌細胞增生抑制藥試驗

1、血管平滑肌細胞增生抑制藥試驗 血管普通可分為內(nèi)膜、中膜和外膜三層，平滑肌細胞是中膜的主要細胞成分。在as和血管重建術后再梗死的主要病理基礎中，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell,vsmc)的移行和過度增殖起著極其重要的作用。每當血管內(nèi)皮細胞受損時，單核細胞和血小板黏附并分泌細胞生長因子，可刺激vsmc移行與增生，已知不少物質具有這類作用。無數(shù)學者認為vsmc是as發(fā)病學的主要實質細胞，在闡明as的病因及發(fā)病機制中有很重要的地位。抑制vsmc移行和增生的物質，可抑制as病變形成和血管成形術后再梗死。vsmc體外培養(yǎng)辦法的建立，有助于了解其分化、生長及其在血管性

2、疾病中的作用及藥物對vsmc的挺直影響。 取動物或人血管的中膜舉行分別，在合適的環(huán)境下能使vsmc舉行生長和傳代。常用家兔、大鼠、牛、豬、羊及流產(chǎn)胎兒主動脈、肺動脈及腦動脈。培養(yǎng)辦法按照試驗要求選取。在相同條件下觀看細胞生長密度，dna合成，可觀看藥物對vsmc生長的影響。 【材料】 1兔、大鼠、豬、牛、猴、人胚、胎兒和成人的血管，均可用于平滑肌細胞培養(yǎng)。取材部位以胸主動脈、降主動脈、肺血管、腦血管、臍血管和腸系膜血管最常用。其中以兔主動脈最常用。 2、培養(yǎng)基、結晶紫、m1t,3h-tdr藥盒。 3儀器與試劑凈化工作臺、c02孵箱、倒置顯微鏡、液體閃耀計數(shù)儀、分光光度計、多孔掃描分光光度計。

3、【辦法】 1貼壁組織塊培養(yǎng)在無菌操作條件下取出所需血管，以hanks液洗去血污，在盛有hanks液培養(yǎng)皿中剝離外膜，縱行剪開血管，使內(nèi)膜朝上平攤于平皿中，以圓鈍的鑷子或剪刀背輕輕刮去內(nèi)皮細胞，將剝?nèi)ネ?、?nèi)膜的動脈中層用培養(yǎng)液洗凈。剪去兩端夾鉗過的組織，以銳利的虹膜剪剪成約1 mm3小塊。用彎頭種植針或尖嘴鑷，將組織塊以互相間隔0.5mm左右距離規(guī)章羅列于培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)皿中，倒置培養(yǎng)瓶或皿，加入含1020的培養(yǎng)液，在37 c02孵箱中靜置57小時后，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中，放回孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，普通47天細胞從組織塊邊緣長出。23周浮現(xiàn)致密的細胞層，這時取出組織塊，使

4、細胞生長至融合。 2簇擁細胞原代培養(yǎng)法又稱酶解離法無菌條件下，將新奇的動脈快速置于含hanks液的平皿中，認真清洗并剝?nèi)パ鼙砻娴睦w維、脂肪和多余的血塊。將血管移入另一含酶消化液（無ca2+-mg2+ hanks液配制的含有1g/l，0.5g/l彈性酶）的平皿中，37消化0.51.5小時后，用眼科鑷認真剝?nèi)ネ饽ぜ巴鈱又心?，刮除?nèi)皮細胞撕下中膜的內(nèi)2/3，注重不要混入內(nèi)皮細胞，將組織塊切成12mm2，移入另一新奇含酶消化液的平皿中，37消化23小時并時常振蕩，收集細胞懸液并用同法再消化一次剩余的組織塊，合并細胞懸液與5倍量含10的培養(yǎng)液混勻于離心管中，1500r/min離心5分鐘，收集細胞并重新

5、懸浮于培養(yǎng)液中調節(jié)細胞數(shù)，然后轉入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，接種密度為（14)x105/cm2。普通2小時后細胞開頭逐漸貼壁，68小時所有貼壁，每23天換培養(yǎng)液一次，12周細胞生長融合成單層細胞時，即可傳代培養(yǎng)。 3微血管平滑肌細胞培養(yǎng)（culture of microvascular smooth muscle cells）大血管和微血管平滑肌細胞的分化及功能較大差別，因此微血管平滑肌細胞的培養(yǎng)近年米亦成為一項重要技術，尤其是在腦血管疾病的討論中。下面以腦血管為例，介紹其微血管平滑肌細胞培養(yǎng)。 無菌條件下，取出大腦半球，置于含有25mmol/l hepes的hanks (ph 7.4)液中，剪碎

6、腦組織并勻漿，勻漿液用孔徑為210um的尼龍網(wǎng)舉行過濾后，將濾網(wǎng)浸于上述液體中且不斷搖擺，以使網(wǎng)上含有大量微血管的組織塊脫落于液體中，800r/min離心5分鐘，將離心所得組織塊溶于消化酶(0.125g/l彈性酶,1g/l膠原酶，0.375g/l大豆胰酶抑制劑，0.2mmol/l，15mmo1/l hepes,2g/l，用dmem配制）中，37水浴振蕩培養(yǎng)60分鐘，用吸管吹打組織懸液，800r/min離心5分鐘，收集細胞團塊并懸浮于培養(yǎng)基中，分裝至培養(yǎng)瓶中，置于37 5% c02培養(yǎng)1218小時，認真吸去未貼壁細胞和細胞團塊，更換新奇培養(yǎng)液。當細胞形成致密層時，即可傳代培養(yǎng)。 當原代細胞生長成

7、片時，即可傳代。傳代時，傾去培養(yǎng)液，以hanks液洗滌培養(yǎng)瓶或皿2次，然后以0.25%-0.02% edta（）混合液籠罩細胞表面，在室溫下作用約2分鐘，在倒置顯微鏡下見到大部分細胞收縮、邊緣清晰（約80細胞成為游離細胞）時即翻轉培養(yǎng)瓶停止消化，傾去消化液，加入含10小牛血清培養(yǎng)液，用吸管輕輕反復輕輕吹打瓶壁，把細胞吹打成懸浮狀，800r/min離心5分鐘，細胞用新奇培養(yǎng)液混勻，舉行細胞計數(shù)。以5x1045x105/ml密度接種在新培養(yǎng)瓶中，在37,5% co2孵箱中培養(yǎng)，每3天換液一次，至細胞生長至致密單層時（710天），可依法舉行其次次傳代。 4試驗設計普通傳至56代，得到數(shù)量較大而又均一

8、細胞，舉行試驗。試驗常在96孔或24孔培養(yǎng)板中舉行。給藥組加入不同濃度藥物，預孵一定時光，與對比組比較，觀看藥物對生長刺激因子的作用。 【結果與分析】 1細胞鑒定 (1)形態(tài)觀看：在倒置相差顯微鏡下，原代和5代以內(nèi)的平滑肌細胞常呈針形，5代以上的平滑肌細胞其外形增大。當細胞長滿瓶底時，典型的平滑肌細胞為梭形或長梭形，平行呈束狀羅列，亦可重疊生長達多層，密集與稀疏交錯呈“峰”與“谷”狀。峰處細胞密集、多層，谷處細胞稀疏，有13層細胞甚至沒有細胞。這一特點易與成纖維細胞區(qū)分，后者可表現(xiàn)為“同心圓”狀的生長形式。 (2）免疫熒光檢查：大多數(shù)狀況下，僅靠光鏡區(qū)分平滑肌細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞是很困難

9、的。利用免疫熒光技術，鑒別分化型平滑肌細胞特有的標志蛋白肌寧蛋白和a一肌動蛋白是一種十分實用的鑒別辦法。 (3）透射電鏡觀看，可把平滑肌細胞分“合成型”與“收縮型”二型。平滑肌細胞原代培養(yǎng)的最初一周以“收縮型”為主，以后逐漸向“合成型”轉化而大量增殖。合成型胞質彌漫粗面內(nèi)質網(wǎng)，囊腔擴大，彌漫蛋白質，核中異染色質較多，但粗或細肌絲很少，肌動蛋白的抗體熒光染色陰性，細胞無收縮功能。“收縮型”細胞是平滑肌細胞的典型表現(xiàn)，主要特征為胞質內(nèi)有成束狀羅列的束狀肌絲，與細胞長軸平行，肌束之間可見與其相連的致密體。細胞膜附近可見特有的密斑和吞飲小泡，細胞有收縮功能。傳代培養(yǎng)細胞最初從“收縮型”轉化為“合成型”

10、很快，約610天又恢復，但已無收縮功能。 2結晶紫染色法將細胞以一定密度接種在24孔培養(yǎng)板，舉行試驗試劑處理，試驗終止時吸出各孔培養(yǎng)液，以1（溶于hanks液）1 ml/孔固定15分鐘，吸出上清液。以0.1結晶紫（溶于三重蒸餾水中）1 ml/孔染色30分鐘，吸出上清液，以去離子水輕輕洗滌15分鐘，吸去上清液，將培養(yǎng)孔在自然條件下晾干，即可在倒置顯微鏡下舉行形態(tài)觀看及照相。然后每孔加入0.2% triton x-100溶液1 ml，使細胞內(nèi)結晶紫溶解，于 595 nm波特長比色舉行吸光值測定，以作定量分析。 3. mtt比色法mtt3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5

11、-diphenyl tetrazolium bromide,溴化四氮唑鹽能進入活的線粒體內(nèi)與各種脫氫酶反應，所以是測定細胞成活及增生的辦法。以pbs溶解mtt制成5 mg/ml溶液，抽濾滅菌。按每孔100ul培養(yǎng)液加入10ul的量，把mtt加入細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，在37繼續(xù)培養(yǎng)4小時。取出培養(yǎng)板，吸出孔中培養(yǎng)液，每孔加入100ul酸性異(0.04ml/l hcl)，使深藍色（甲攢）結晶徹底溶解。在室溫下放置數(shù)分鐘，確認結晶徹低溶解后即把培養(yǎng)板在波長570nm,630nm，校準設在1.99（如樣品著色過強，則設在1.00）的多孔掃描分光下讀數(shù)。在加入異丙醇后1小時內(nèi)測定完畢。也可以(dmso) 320

12、微升孔代替異丙醇溶解細胞內(nèi)mtt，在酶聯(lián)免疫測定儀上于波長570nm或570nm,630nm雙波特長測定吸光值并分析。 4. 3h-tdr放免測定待測細胞吸去培養(yǎng)液，每孔加入含，h-tdr培養(yǎng)液200ul（含發(fā)射量3.7x104bq)，在37孵育24小時后終止培養(yǎng)。以冷pbs 200ul清洗3次，加入4 10200ul，放入4冰箱30分鐘，吸去酸，加入乙醚：（1：2)混合液200ul漂洗，吸去液體，晾干。加入0.4mo1/l naoh溶液200微升孔溶解細胞，在56恒溫箱中放置2小時，吸出所有液體注入含有5m1閃耀液的閃耀瓶中，加蓋搖勻，放置2小時后舉行液閃測定。 【注重事項】 1平滑肌細胞取材廣泛，但以年幼動物的血管較易培養(yǎng)成活。血管的新奇程度也非常重要，新奇的血管，易于培養(yǎng)勝利，取材時快速將游離的血管置于hanks液或培養(yǎng)液，并在2小時內(nèi)舉行分別培養(yǎng)。 2將血管的內(nèi)、外膜徹底剝離整潔是保證培養(yǎng)細胞純度的關鍵。剝離時，動作要輕柔，盡量削減組織損傷，棄去已夾過的組織。小牛血清質量與試驗關系疏遠。有條件可加入pdgf等細胞生長因子。游離細胞培養(yǎng)時還應注重膠原酶和彈性酶的純度，以及酶的活性，以保證分別消化