廣棗總黃酮對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡及腺苷脫氨酶(ADA)活性的影響

1、    廣棗總黃酮對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡及 腺苷脫氨酶(ADA)活性的影響        【摘要】目的 研究蒙藥廣棗總黃酮（TFC）對(duì)地塞米松（DEX）誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞調(diào)亡及胸腺細(xì)胞內(nèi)腺苷脫氨酶（ADA）活性隆低的免疫調(diào)節(jié)作用。方法 將小鼠分為DEX組、TFC組、TFC+DEX組和正常對(duì)照組，采用光鏡(計(jì)凋亡率，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析)、電鏡(形態(tài)學(xué)觀察)。DNA瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度比色法(吸光度值經(jīng)t檢驗(yàn)處理)在培養(yǎng)3，6，9，12，24小時(shí)動(dòng)態(tài)觀察下，研究TFC對(duì)

2、胸腺細(xì)胞凋亡及ADA活性的影響。 結(jié)果在不同的培養(yǎng)時(shí)間均看到TFC抑制DEX誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡(P<0.01)及TFC的促胸腺細(xì)胞分裂、增殖現(xiàn)象，但TFC對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的自發(fā)凋亡似無(wú)抑制作用(P>0.05)；TFC可促進(jìn)胸腺萎縮小鼠的胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性恢復(fù)(P<0.01)。 結(jié)論TFC有提高機(jī)體免疫功能作用，這對(duì)臨床上應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的免疫缺陷、重癥感染及腫瘤等的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【主題詞】廣棗黃酮胸腺細(xì)胞凋亡腺苷脫氨酶 Effects of total flavones of choerospondias axillaris (TFC) on thymocyte ap

3、optosis and ADA activation of miceLi Bin,Tian Guocai,Lin Na,et al.Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital,Mongolian Medical College,Huhehot 010059【Abstract】Objective Dexamethason is a common immunosuppressant.It can induce immunodeficinency in the patients who take it for a long time,the

4、 causes of which have been proved due to mainly thymus atrophy,originally thymocyte apoptosis as well as ADA activity lowered. TFC is a Mongolian traditional drug that can promote the cell-mediated and humoral immune responses.In order to study the effect of TFC on dexamethason induced thymocyte apo

5、ptosis in mice and the influence of TFC on ADA activity in the thymocytes. MethodsThe thymocytes were incubated respectively for 3,6,9,12 and 24 hours with dexamethason,TFC,dexamethason+TFC.The cells of apoptosis were observed with aptical the microscope for counting the proportion of apoptosis and

6、the data treated with analysis of variance,and the electronic microscopy for morphology,DNA agarose gel electrophoresis and ADA activity was detected with spectrophotometer(A value treated with t-test). ResultsThe results showed that TFC could inhibit dexamethason-induced thymocyte apoptosis (P<0

7、.01) and promote proliferation differentiation of the thymocytes in different periods.But TFC could not inhibit natural apoptosis of the incubated cells(P>0.05).In addition,TFC also could facilitate the restoration of ADA activation of the thymocytes in the thymus astrophy mice.ConclusionIt can b

8、e seen that TFC can promote the immune responses of the body,which provides a powerful evidence for the treatment of immunodefiency,serious infections and tumors induced by the application of gluco-corticoid hormone in the clinic.【Subject words】ThymocyteApoptosisFlavones choerospondias axillarisAden

9、osine deaminase細(xì)胞凋亡(Apoptosis or program cell death)是多細(xì)胞動(dòng)物發(fā)育、成熟、生命過(guò)程中所不可或缺的細(xì)胞事件，機(jī)體組織是通過(guò)細(xì)胞增殖與凋亡的平衡使機(jī)體維持正常結(jié)構(gòu)與功能的生理性死亡過(guò)程。同樣，細(xì)胞凋亡參與胸腺細(xì)胞陰性選擇，免疫耐受和維持正常免疫功能等。廣棗為漆樹(shù)科植物Choerospondias axillaris (Roxb)Burtt et Hill的成熟果實(shí)，蒙醫(yī)用以主治心悸不安，有行氣活血，養(yǎng)血安神的作用1。近年來(lái)，本室研究和報(bào)道的資料表明，廣棗總黃酮(TFC)有增強(qiáng)免疫的作用2，可提高小鼠胸腺細(xì)胞增殖率及增強(qiáng)細(xì)胞水解酶和脫氫酶活力3。

10、但TFC對(duì)胸腺細(xì)胞凋亡及對(duì)胸腺細(xì)胞ADA活性的影響，尚無(wú)報(bào)道。本研究應(yīng)用光鏡、電鏡形態(tài)學(xué)檢查和DNA瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)研究了TFC對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞自發(fā)的和DEX誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡以及DEX致胸腺萎縮小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性及胸腺重量的影響，為闡明TFC的免疫調(diào)節(jié)和臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠，雌雄各半，體重(16±2)g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2.主要試劑：地塞米松磷酸鈉(DEX，江蘇興化制藥廠)；蛋白酶K(Sigma公司)；RNase A (SABC); DNA/EcoR+Hindmarkers(華美生物工程公司)；腺苷(adenosin

11、e,Sigma公司)。3.藥物：廣棗總黃酮注射液(total flavones of choerospondias injection),由內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)研究所藥物室提供。4.小鼠胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)(1)胸腺細(xì)胞培養(yǎng)：將新鮮制備的107/ml胸腺細(xì)胞6ml加入各平皿中，分4組：正常對(duì)照組(I)；地塞米松組()，終濃度為10-5mol/L；10-5mol/L DEX+40g/ml TFC組()；TFC組()，濃度為40g/ml(以上各有效劑量均為預(yù)試所確定)。然后置5% CO2培養(yǎng)箱中，37分別于培養(yǎng)后3，6，9，12，24小時(shí)取出，離心，收獲細(xì)胞備用(在觀察TFC本身對(duì)小鼠新鮮胸腺細(xì)胞無(wú)毒害作用后

12、做本試驗(yàn))。(2)光鏡檢查：按Gavrieli4等方法操作。將胸腺細(xì)胞中加入甲醛，室溫下固定10分鐘，放一滴于APES薄片上，晾干后HE染色，油鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)其中凋亡的細(xì)胞數(shù)，以計(jì)算凋亡率。(3)電鏡檢查：將收獲的胸腺細(xì)胞按常規(guī)方法制備，超薄切片制作標(biāo)本，電鏡觀察(放大4800倍)。(4)DNA片段提取及電泳測(cè)定：采用Facchinetti5等方法。簡(jiǎn)言之，將胸腺細(xì)胞加5倍體積裂解液，50水浴1小時(shí)后，以酚，氯仿/異戊醇抽提，DNA溶液中加氯化鎂乙酸鈉混合液和無(wú)水乙醇，-20過(guò)夜。離心后向沉淀中加入70%乙醇，洗滌后溶于TE中，再加RNase A及蛋白酶K，50 水浴過(guò)夜。于含溴

13、乙錠的 1.8%瓊脂糖凝膠中電泳1.5小時(shí)，電壓60V，紫外燈下觀察DNA梯狀帶(DNA ladder)并照像。5.小鼠胸腺細(xì)胞ADA活性及胸腺重量測(cè)定(1)實(shí)驗(yàn)分組及胸腺重量測(cè)定：隨機(jī)將昆明鼠(雌雄各半)240只分3組，每組80只。組為正常對(duì)照組；組為地塞米松組，腹腔注射地塞米松100g；組為DEX+TFC組，腹腔注射DEX(100g)1小時(shí)后，再注射TFC(2500g)，連續(xù)10天。并每日、組各殺8只，分別測(cè)小鼠重量，胸腺重量，并制成107/ml胸腺細(xì)胞懸液備用。(2)胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性檢測(cè)：將胸腺細(xì)胞液離心，棄上清，沉淀中加雙蒸水，在超聲粉碎機(jī)上破壞細(xì)胞，離心，吸上清液，按文獻(xiàn)6方法，

14、在260nm紫外分光光度下比色，測(cè)胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA吸光度(A)值。結(jié)果1.TFC體外對(duì)DEX致小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響(1)電鏡觀察：均為體外培養(yǎng)6小時(shí)電鏡(4800倍)所見(jiàn)。組細(xì)胞形態(tài)正常(1A)；DEX組(組)胸腺細(xì)胞變圓，體積縮小，胞漿濃縮，核染色質(zhì)濃集于核膜周邊，形成凋亡小體和空泡等，但細(xì)胞膜本身完整呈典型的凋亡的形態(tài)(1B)；組(DEX+TFC)大部分胸腺細(xì)胞形態(tài)正常，一部分呈分裂、增殖像，少數(shù)細(xì)胞呈凋亡的形態(tài)(1C)；組(TFC組)可見(jiàn)到明顯分裂增殖像(1D)。1TFC對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡作用的形態(tài)學(xué)特征(放大4800倍)Fig 1. Morphologic characterizat

15、ion of apoptosis in murine thymocytes(4800×)A：Normal control, B:Thymocytes+DEX,C:Thymocytes+DEX+TFC, D:Thymocytes+TFC(2)細(xì)胞凋亡率比較：光鏡下4組體外培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率動(dòng)態(tài)觀察表明，DEX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在培養(yǎng)3小時(shí)即出現(xiàn)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至24小時(shí)4組均出現(xiàn)凋亡。但各組曲線型不一，組呈直線上升；組則于9小時(shí)前呈直線升高，之后趨于平穩(wěn)，遠(yuǎn)低于組(P<0.01),而、組細(xì)胞凋亡率曲線相近(2)。試驗(yàn)證明，TFC有抑制DEX致胸腺細(xì)胞凋亡的作用，但對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的自發(fā)凋亡

16、，似無(wú)明顯抑制作用。2胸腺細(xì)胞凋亡率曲線Fig 2. The curve of apoptosisThe thymocytes were incubated with DEX(10-5mol/L)();DEX(105mol/L)+TFC(40g/ml)();or TFC(40g/ml)() as control()(3)DNA瓊脂糖電泳結(jié)果：在培養(yǎng)6小時(shí)時(shí)，組(DEX)DNA電泳后呈典型的“階梯狀”(ladder)條帶，與標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA參照物比較，DNA裂解為不連續(xù)的180200bp整數(shù)多倍體的DNA片段，、組均未出現(xiàn)“階梯帶”(3A)；培養(yǎng)12小時(shí)時(shí)，組(DEX)、組(DEX+TFC)均出

17、現(xiàn)“階梯帶”(3B)；培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，4組均出現(xiàn)典型“階梯狀條帶”，提示有自然凋亡發(fā)生(3C)。試驗(yàn)證明，TFC在體外可早期抑制DEX誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡，而對(duì)細(xì)胞自發(fā)凋亡無(wú)明顯影響，并且這一所見(jiàn)與2結(jié)果一致。 3TFC對(duì)體外培養(yǎng)不同時(shí)間的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳分析Fig 3. Effect of TFC on apoptosis in murine thymocytes at different times by DNA agarose gel electrophoresis The thymocytes were incubated for 6 hours (A);12

18、hours(B) and 24 hours(C)Lane 1:Cultured thymocytes(); Lane 2:DEX(10-5mol/L)();Lane 3:TFC(40g/ml)(); Lane 4:DEX(10-5mol/L+TFC(40g/ml)(); Lane 5:Markers(4)TFC抑制凋亡的劑量依賴關(guān)系：在TFC抑制凋亡的試驗(yàn)中，我們?cè)囼?yàn)過(guò)TFC的5種劑量，即終濃度分別為8.3g/ml(50g/6ml);25.0g/ml(150g/6ml);41.6g/ml(250g/6ml);83.3g/ml(500g/6ml),最后又試用40.0g/ml(240g/6ml)

19、。從光鏡計(jì)凋亡率及DNA電泳結(jié)果中均顯示出，TFC 8.3g/ml及 25.0g/ml不能抑制凋亡，而TFC40g/ml, 41.6g/ml與83.3g/ml均可抑制凋亡；并且TFC 40g/ml與83.3g/ml劑量在對(duì)凋亡的抑制程度上無(wú)顯著差異(P>0.05)，所以本試驗(yàn)選定的TFC劑量為40g/ml。2.TFC體內(nèi)對(duì)免疫缺陷鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性及胸腺重量的影響：我們?cè)诮o小鼠腹腔注射13天內(nèi)，可見(jiàn)到DEX(組)及DEX+TFC(組)小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性明顯下降，達(dá)最低值。組ADA活性于第4天開(kāi)始升高，以后呈鋸齒形上升，于第10天時(shí)，ADA活性仍未達(dá)正常水平。而組從第5天開(kāi)始AD

20、A活性逐漸恢復(fù)，也呈鋸齒形上升，但第310天間，組小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性顯著高于組(P<0.01)(4)，說(shuō)明TFC對(duì)DEX所致免疫缺陷鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性的恢復(fù)有明顯促進(jìn)作用。但胸腺重量在給藥后組及組均同時(shí)降低，從第69天、兩組胸腺重量均開(kāi)始逐漸恢復(fù)，兩曲線平行上升(P>0.05)，第10天時(shí)，組小鼠胸腺重量明顯增加，并接近正常，在此劑量范圍內(nèi)未見(jiàn)TFC有抗DEX造成的胸腺萎縮作用(5)。4TFC對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞ADA活性作用Fig 4. Effect of TFC on ADA activation in murine thymocytes:Normal control; :

21、DEX(100g); :DEX(100g)+TFC(2500g)5TFC對(duì)小鼠胸腺重量影響Fig 5.Effect of TFC on weight of murine thymus:Normal control; :DEX(100g); :DEX(100g)+TFC(2500g)討論細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制和一定的生理或病理?xiàng)l件下遵循自身規(guī)律，有程序地自己結(jié)束其生命的死亡。本文從光鏡、電鏡下呈現(xiàn)出典型的形態(tài)學(xué)和DNA片段的生化特征說(shuō)明，在體外用地塞米松誘導(dǎo)了胸腺細(xì)胞的凋亡，同時(shí)證實(shí)了TFC對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞有明顯促增殖作用。此外，在TFC與DEX共同加入胸腺細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)，TFC有明顯抑制

22、DEX誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡的作用，從而表明TFC有調(diào)變細(xì)胞免疫缺陷的功能。根據(jù)Grassilli等7報(bào)道，在APO與細(xì)胞增殖間存在著深?yuàn)W的關(guān)系。已知鋅之阻斷DEX誘導(dǎo)的胸腺DNA斷裂是通過(guò)它促進(jìn)RNA、DNA合成導(dǎo)致T、B淋巴細(xì)胞分裂增殖所致8。本研究證實(shí)了TFC在體外促進(jìn)小鼠胸腺細(xì)胞增殖，同時(shí)也具有抑制DEX誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的作用，提示廣棗具有免疫調(diào)節(jié)功能。有關(guān)TFC此兩種不同的作用機(jī)制尚不清楚，鑒于bcl-2能在多種正常細(xì)胞激活后和發(fā)育中表達(dá)，并且bcl-2表達(dá)可抑制多種細(xì)胞凋亡9，10，胸腺細(xì)胞多為不成熟T細(xì)胞，所以當(dāng)TFC激活胸腺細(xì)胞使其增殖后可促進(jìn)bcl-2表達(dá)，以致專一性地抑制由許

23、多刺激因素(包括DEX)所誘導(dǎo)的凋亡。提示TFC似與絲裂原和生長(zhǎng)因子等免疫增強(qiáng)劑作用相同。因此，我們推想，TFC抑制細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制主要與其促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖有關(guān)。ADA是嘌呤核苷酸分解代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，以淋巴細(xì)胞中活性最高，T淋巴細(xì)胞比B淋巴細(xì)胞活性更高。當(dāng)ADA缺乏或活性受抑制時(shí)，能引起腺苷積聚，干擾內(nèi)源性嘧啶合成，從而對(duì)淋巴細(xì)胞有毒性，還可引起脫氧腺苷積聚，導(dǎo)致脫氧三磷酸腺苷(dATP)堆積，因而干擾DNA合成，所以淋巴細(xì)胞中ADA活性改變直接影響免疫功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在傷寒、結(jié)核、重癥聯(lián)合免疫缺陷病、腫瘤、SLE等均有淋巴細(xì)胞ADA活性降低的報(bào)道，因此ADA活性成為反映機(jī)體細(xì)胞免疫功

24、能的一個(gè)重要指標(biāo)。小鼠體內(nèi)注射DEX后其胸腺重量及胸腺細(xì)胞內(nèi)ADA活性明顯降低，但在腹腔注射DEX后再注射TFC，盡管在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未見(jiàn)其明顯抑制DEX造成的胸腺萎縮，但卻能促進(jìn)胸腺細(xì)胞ADA活性的恢復(fù)，有提高細(xì)胞免疫功能的作用。鑒于糖皮質(zhì)激素可體外誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡，同時(shí)能降低胸腺細(xì)胞的ADA活性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)，TFC能抑制前者的凋亡和促進(jìn)恢復(fù)后者所致的ADA活性，以提高機(jī)體免疫功能，這對(duì)臨床上應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等導(dǎo)致的免疫缺陷和重癥感染、腫瘤等的治療，提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；亦拓寬了蒙藥廣棗總黃酮的傳統(tǒng)應(yīng)用范圍，開(kāi)辟了蒙藥的應(yīng)用前景。作者單位：010059 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院一附院兒科李嬪(碩士研

25、究生)，崔淑蘭；內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院微生物、免疫學(xué)教研室(田國(guó)才，林娜)；呼和浩特鐵路局生衛(wèi)處(及金寶)參考文獻(xiàn)1鄧麗嘉，王月梅，顧維彰.蒙藥廣棗化學(xué)成分研究.中草藥，1989，20(3)8-9.2王玉珍，任建梅，王若愚.廣棗總黃酮對(duì)小鼠免疫功能的影響.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1991，7(3)214-217.3Tian Guocai,Liu Zhao,Li Lanyin,et al.The influence of fructus choerospondias on the cytochemical reaction and proliferation response of thymocytes in mice.Chin J Histochem Cytochem,1993,2148-149.4Gavrieli Y,Sherman Y,Shmuel A,et al.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119(3)493-501.5Facchinetti L,Tessarollo M,Mazzocchi R,e