雜環(huán)胺中國煙草標(biāo)準(zhǔn)化

1、卷煙 主流煙氣中主要雜環(huán)胺類化合物（AC, MeAC, Trp-p-1和 Trp-p-2）的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)報告中國煙草總公司鄭州煙草研究院2011.8目錄一、前言.11 概述.1 2 卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的前處理方法.3 3 卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的分析測定方法.3 3.1 氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法3 3.2 液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法4 3.3 毛細(xì)管區(qū)域電泳5 3.4 酶聯(lián)接免疫吸附劑測定法.5 3.5 小結(jié)6二、卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類的分析.6 1 儀器與試劑.6 2 卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類化合物的收集和前處理.7 3 液相色譜和質(zhì)譜條件.8 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制.9 5

2、 主流煙氣中主要雜環(huán)胺的定性和定量測定10三、討論11 1 超聲萃取溶劑選擇11 2 不同萃取方式的影響11 3 不同超聲萃取時間的影響124 固相萃取過程中待測目標(biāo)物的保留情況125 待測目標(biāo)物洗脫體積的確定136 流動相pH值的影響.147 前處理后樣品的穩(wěn)定性 .158 不同類型吸煙機(jī)的影響159 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢測限1610 精密度和回收率.1611 雜環(huán)胺比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1712 卷煙樣品的測定結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果的比較.17參考文獻(xiàn)19一、前言1. 概述雜環(huán)胺類化合物是卷煙煙氣中非常重要的兩類有害成分，主要是在卷煙抽吸過程中由含氮化合物和含氧化合物燃燒、裂解而產(chǎn)生的，在主流煙氣中的釋放

3、量較低，基本在納克級的水平，但生物活性非常強(qiáng)，這些物質(zhì)具有致癌或致突變作用，對人體健康具有較強(qiáng)的危害性。HOFFMANN在2001年公布的69種有害成分清單中，就包括8種雜環(huán)胺類化合物。近年來，社會各界對吸煙與健康的問題日益關(guān)注，隨著我國政府簽署了煙草框架公約（FCTC），對煙草中有害成分信息披露的要求也越來越高。因此為了更好地評價卷煙煙氣的危害性，目前很有必要對以上雜環(huán)胺類化合物進(jìn)行比較詳細(xì)的研究，特別是在分析方法上，需要發(fā)展準(zhǔn)確有效的分析技術(shù)對其進(jìn)行定量的描述，這樣才能科學(xué)評價其對卷煙危害性的影響，研究這些有害成分的形成機(jī)理，為開發(fā)煙氣有害成分降低技術(shù)提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。雜環(huán)胺是由蛋白質(zhì)、

4、氨基酸熱解產(chǎn)生的一類化合物，多種煎炸食品1-6、咖啡飲料7、卷煙煙氣8-13、江河水14以及尿樣6,15,16中都可以檢測到這類化合物的存在。雜環(huán)胺具有強(qiáng)烈的致癌性和致突變性，可引起哺乳動物的基因突變、染色體畸變及姐妹染色體變換等，其中一些雜環(huán)胺類化合物的致突變活性很強(qiáng)，一些還被證明可以引起實(shí)驗(yàn)動物多種組織的腫瘤。這類化合物在環(huán)境和日常食品中普遍存在，它們造成的健康危害已成為食品安全領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。1939年，瑞典科學(xué)家Widmark用烤馬肉提取物反復(fù)涂抹于小鼠背部皮膚，發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)小鼠乳腺腫瘤17，但這一重要結(jié)果在當(dāng)時并未引起人們的重視。多年后，Sugimura18發(fā)現(xiàn)魚和肉類食品經(jīng)

5、烹調(diào)后可形成具致突變性的物質(zhì)，同年Nagao發(fā)現(xiàn)烤魚及肉的煙氣中具有致癌物質(zhì)19,20，激發(fā)了人們對氨基酸、蛋白質(zhì)熱解產(chǎn)物的研究興趣，從而導(dǎo)致了新的致癌、致突變物的發(fā)現(xiàn)，并將這一類物質(zhì)歸為雜環(huán)胺類物質(zhì)。目前大量研究已證明，大部分雜環(huán)胺類物質(zhì)具有致癌、致突變性，它可以導(dǎo)致小白鼠的肝癌、大小腸癌、口腔癌、胰腺癌以及乳腺癌等等。雜環(huán)胺進(jìn)入人體后，主要是在P450細(xì)胞色素氧化酶的作用下，發(fā)生N-氧化和O-乙?；磻?yīng)生成DNA加合物后產(chǎn)生致突變和致癌作用21-27。迄今為止，已從烹調(diào)的食品分離鑒定的具有有的致突變和/或致癌雜環(huán)胺物質(zhì)已超過20種。對于煙氣中的雜環(huán)胺的研究起始于1962 Poindexte

6、r and Carpenter報道了卷煙煙氣中含有哈爾滿與降哈爾滿（-咔啉）8。上個世紀(jì)八十年代初，Yoshida 與 Matsumoto28對煙氣中雜環(huán)胺的分析檢測，檢測的雜環(huán)胺有AaC與MeAaC，他們分別用HPLC-熒光檢測器定量分析了烤牛肉與卷煙主流煙氣中AaC與MeAaC，發(fā)現(xiàn)對于這兩種雜環(huán)胺，9g烤牛肉的雜環(huán)胺含量與23支卷煙主流煙氣中的含量相類似。1998年D Hoffmann與I Hoffmann發(fā)表了一份無濾嘴香煙主流煙氣中具生物活性的物質(zhì)的名單，其中包括Trp-P-1、Trp-p-2等八種雜環(huán)胺類化合物29。表1和圖1為煙氣中可能存在的八種雜環(huán)胺類化合物名稱、致癌等級以及結(jié)

7、構(gòu)圖。表1 卷煙煙氣中的主要雜環(huán)胺類化合物化合物名稱縮寫CAS號致癌性2-氨基-9H-吡啶并2,3-b吲哚AC26148-68-52B2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并2,3-b 吲哚MeAC68006-83-72B2-氨基-3-甲基咪唑并4,5-f喹啉IQ76180-96-62A2-氨基-1-甲基 -6-苯基咪唑并4,5-b吡啶PHIP105650-23-52B2-氨基-6-甲基-二吡啶并1,2-a:3,2-d 咪唑Glu-P-167730-11-42B2-氨基二吡啶并1,2-a:3,2-d 并咪唑Glu-P-267730-10-32B3-氨基- 1,4-二甲基-5H-吡啶并4,3-b吲哚Tr

8、p-P-162450-06-02B3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并4,3-b吲哚Trp-P-272254-58-12B圖1 卷煙煙氣中的主要雜環(huán)胺類化合物的結(jié)構(gòu)圖2. 卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的前處理方法由于煙氣樣品的復(fù)雜性、樣品中雜環(huán)胺含量較低（大多為ng級別）并且存在大量的基質(zhì)影響，導(dǎo)致了實(shí)際的樣品分析中提取過雜環(huán)胺以后，要進(jìn)一步進(jìn)行分離純化來排除樣品中其它物質(zhì)的干擾。雜環(huán)胺屬于有機(jī)堿，通常都是用有機(jī)溶劑或酸性水溶液來提取，再用CH2Cl2 10,30-31、乙酸乙酯30,32,33等進(jìn)行液液萃取除去酸性或中性雜質(zhì)，此外，除有機(jī)溶劑或酸性水溶液外，卷煙煙氣還常用玻璃纖維進(jìn)行捕集28,34,35

9、,再用有機(jī)溶劑進(jìn)行洗滌。Kataoka H等11采用液液萃取法提取了卷煙主側(cè)流煙氣中的雜環(huán)胺，作者先用人造纖維富集煙氣中的雜環(huán)胺，再用甲醇/氨（50：1）洗滌，調(diào)節(jié)洗滌液的pH值后，用CH2Cl2重新萃取，最后作者在卷煙主側(cè)流煙氣中檢測到了AaC、Trp-P-1、IQ和PHIP。Sasaki T A等10采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環(huán)胺，作者先用0.1M的鹽酸萃取劍橋?yàn)V片，調(diào)節(jié)pH值后，再用CH2Cl2萃取，檢測到IQ和PHIP。Yukari Totsuka等人13用有機(jī)溶劑萃取卷煙煙氣濾片后，再用藍(lán)棉提取雜環(huán)胺，以甲醇/氨洗脫，定量分析了哈爾滿與降哈爾滿。液液萃取方法是常用的分離方

10、法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、方便，但費(fèi)時、費(fèi)力，因該方法需要大量不混溶的溶劑，有些是有毒、易揮發(fā)、易燃的，在樣品預(yù)處理方面存在局限性，所以需要尋找更好的樣品預(yù)處理方法。近年來，固相萃取法得到了日益廣泛的應(yīng)用。因?yàn)樗哂袠悠诽幚硌杆伲僮骱唵?、方便，避免乳化現(xiàn)象，易于自動化操作等優(yōu)點(diǎn)。1996年，Gross G A等36,37提出了固相萃取的方式來分離純化復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺。該方法既可以提高萃取率，又可以節(jié)省時間和費(fèi)用，減少樣品的用量，同時提取復(fù)雜樣品中的多種雜環(huán)胺。經(jīng)過近年來不斷修改，幾乎成為雜環(huán)胺分析測定的標(biāo)準(zhǔn)前處理方法，用來測定的樣品也覆蓋了許多含有雜環(huán)胺類化合物的樣品，3. 卷煙主流煙氣中雜環(huán)

11、胺的分析測定方法 鑒定復(fù)雜樣品中雜環(huán)胺的方法很多，液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用，毛細(xì)管區(qū)域電泳儀和酶聯(lián)免疫吸附劑測定等方法都已經(jīng)被用來定性定量分析復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺。3.1 氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用法氣相色譜由于其簡單、靈敏度高以及耗費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在雜環(huán)胺的分析測定中，但是由于大多數(shù)的雜環(huán)胺是低揮發(fā)性，并且具有一定的極性，在氣相分析時對氣相色譜柱和進(jìn)樣口有很強(qiáng)的吸附性，色譜峰會趨向于出現(xiàn)寬峰或拖尾峰，因此雜環(huán)胺在進(jìn)行氣相色譜分析之前要先進(jìn)行衍生化。雜環(huán)胺的衍生化不僅可以減少雜環(huán)胺的極性，而且可以提高雜環(huán)胺的揮發(fā)性、靈敏度、選擇性以及分離度。三氟甲基苯甲酰38、五氟丙酸酐、七氟丁

12、酸酐、N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛等很多衍生化試劑都可以用來衍生化雜環(huán)胺 37,39-45。因?yàn)檠苌镏泻蠳原子，氮磷檢測器常用來檢測雜環(huán)胺的衍生物。Kataoka46等建立了一種簡單快速的衍生方法，作者采用DMF-DMA衍生、GC-NPD測定了10種具有致突變性的雜環(huán)胺。該研究組11還采用鹽酸/抗壞血酸對捕集卷煙主、側(cè)流煙氣后，用藍(lán)棉處理，再用DMF-DMA對雜環(huán)胺衍生，以GC/NPD分析，檢測到卷煙煙氣中雜環(huán)胺AaC 、Trp-p-1、IQ、 PHIP和MeIQ。氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合了氣相色譜簡單耗費(fèi)低的優(yōu)點(diǎn)以及質(zhì)譜高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)。其中，和EI相比，負(fù)化學(xué)電離(NCI)對于含氮的化合

13、物的選擇性更好、靈敏度更高，比較適合復(fù)雜樣品中痕量雜環(huán)胺的鑒定47-49，和氣相色譜方法相同，雜環(huán)胺類化合物在色譜分析之前通常要先進(jìn)行衍生化過程。但Christopher 47等未對雜環(huán)胺化合物進(jìn)行衍生，直接進(jìn)GC/MS分析。作者用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl超聲萃取后過MCX固相萃取柱凈化樣品，洗脫液蒸干后用乙腈溶解后進(jìn)GC/MS分析。采用外標(biāo)法對哈爾滿、 降哈爾滿、AaC和MeAaC定量分析。哈爾滿與降哈爾滿的檢測限分別是33.1 和 84.7 ng/支， AaC 和 MeAaC的檢測限為3.1和1.4 ng/支。兩個加標(biāo)水平30 and 750 ng/支的回收率都在79.9和102%

14、之間。Sasaki T A等10用濾片捕集主流煙氣粒相物，用HCl萃取后調(diào)節(jié)pH值，再用CH2Cl2重新萃取，之后用七氟丁酐(HFBA )和N,N-二甲基甲酰胺對雜環(huán)胺進(jìn)行兩步衍生，用 NCI- GC-MS（選擇離子監(jiān)測）分析。用此種方法檢測了煙氣中PHIP和IQ，濃度水平0.5 ng/支，方法的檢測限為0.10.5 ng/支。3.2 液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用法HPLC是一種普遍有效的分析雜環(huán)胺的方法，每一種雜環(huán)胺都有特征的紫外光譜和較高的消光系數(shù)，并且它們都是電化學(xué)可氧化的，因此這些化合物可以通過紫外、電化學(xué)和熒光法來檢測。在高效液相方法中，紫外吸收檢測是最普遍的方法，大多數(shù)的雜環(huán)胺在260-27

15、5nm內(nèi)都可以被檢測。但是樣品的復(fù)雜性使得該方法的選擇性不高。Gross等50采用窄孔色譜柱Vydac 201HS52(25cm×2.1mm I.D)檢測了肉類制品中的12種雜環(huán)胺和哈爾滿，使用該柱子的靈敏度比常規(guī)柱子（直徑4.6mm）要高三倍，該方法已經(jīng)被很多研究者采納。熒光檢測器常與紫外檢測器同時應(yīng)用，IQ類型的雜環(huán)胺類化合物無熒光吸收，需用紫外檢測器來確認(rèn)。熒光檢測器與紫外檢測器相比，靈敏度更高，選擇性好，并且色譜圖更“干凈” 4。Shige等34用玻璃纖維捕集主流煙氣粒相物。纖維用和甲醇和氨水超聲萃取，蒸干后用20 ml CH2Cl2溶解，過反相柱Bond Elut SI c

16、olumn，最后用HPLC-UV分析，檢測到卷煙中的PHIP平均值含量為16.4 ng/支。液質(zhì)聯(lián)用方法集中了高效液相分離程度高以及質(zhì)譜選擇性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，該方法可以減少復(fù)雜樣品中其他物質(zhì)的干擾，而且可以解決分離過程中的費(fèi)時費(fèi)力問題，比較適合雜環(huán)胺類化合物的定性定量分析。由于基質(zhì)的復(fù)雜性及目標(biāo)化合物含量低的特點(diǎn)，要取得可靠的結(jié)果，分離及檢測方法必須具有一定的選擇性和靈敏度。當(dāng)前采用液質(zhì)聯(lián)用分析雜環(huán)胺時廣泛采用的接口技術(shù)有熱噴霧(TSP) 、電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)等。LC-TSP-MS在80年代中期曾是成功的接口，該技術(shù)中進(jìn)行的離子化是軟離子化，碎裂程度較小，通過檢

17、測雜環(huán)胺類化合物的M+H+峰可以檢測到復(fù)雜樣品中的雜環(huán)胺類化合物， Edmonds51-52首次采用該方法測定了經(jīng)過烹調(diào)后的肉和魚中的雜環(huán)胺類物質(zhì)，但是LC-TSP-MS所提供的結(jié)構(gòu)信息有限，并且它不適合熱不穩(wěn)定化合物。隨著技術(shù)的發(fā)展，又出現(xiàn)了采用LC- ESI MS、LC- APCI MS技術(shù)檢測樣品中雜環(huán)胺類物質(zhì)的方法，ESI和APCI都是噴霧型的軟電離技術(shù)，它們的高電離效率已成為目前最理想的LC/MS接口技術(shù)。3.3 毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)毛細(xì)管區(qū)域電泳是一種新的高分辨率分析技術(shù)，它兼有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜法的高效率等優(yōu)點(diǎn)，與高效液相方法相比，毛細(xì)管區(qū)域電泳可以達(dá)到較

18、高的分離效率，并且需要的有機(jī)溶劑少，樣品用量小，雜環(huán)胺的毛細(xì)管區(qū)域電泳法近幾年來才被發(fā)展起來。1995年Wu等53首次采用該方法成功的分離了Trp-P-1、Trp-p-2、AaC、MeAaC、IQ、MeIQ等30種雜環(huán)胺，該方法的檢測限為0.05-1.3ng/l。3.4 酶聯(lián)接免疫吸附劑測定法(ELISA)ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度高和分析成本低的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被應(yīng)用在測定具有致癌性的雜環(huán)胺類物質(zhì)中。1988年Vanderlaan等54就采用該方法分析了復(fù)雜樣品

19、中的IQ、MeIQ和PHIP等。3.5 小結(jié)盡管卷煙煙氣中雜環(huán)胺類化合物已經(jīng)有了一些研究報道，但由于雜環(huán)胺在卷煙煙氣中的釋放量很低，煙氣復(fù)雜基質(zhì)對其分離和分析有著非常嚴(yán)重的干擾，因此給它的分離檢測帶來了困難。氣相色譜分析通常需要進(jìn)行衍生化，穩(wěn)定性較差，并且由于煙氣基質(zhì)的干擾經(jīng)常會產(chǎn)生錯誤的分析結(jié)果。HPLC-UV是同時測定多種雜環(huán)胺最有效的辦法，但是它的靈敏度不高。HPLC-ED和HPLC-FLD雖然選擇性和靈敏度比較好，但是只能選擇性的檢測幾種雜環(huán)胺。CZE技術(shù)采用光電二極管陣列檢測器可以達(dá)到比較高的分離效率，但是它的靈敏度不高。ELISA法需要先產(chǎn)生抗體才能分析雜環(huán)胺類化合物。由于以上分析

20、方法的原因，目前卷煙煙氣雜環(huán)胺的研究經(jīng)常有一些相互矛盾的報道，不同研究人員在卷煙煙氣中檢出的雜環(huán)胺種類和釋放量有比較大的差異。Moldoveanu等采用液液萃取法提取了卷煙主流煙氣中的雜環(huán)胺，衍生后采用氣相色譜-質(zhì)譜-化學(xué)源負(fù)離子模式檢測，檢測到IQ和PHIP 10。Kataoka等將蘭棉吸附和液液萃取相結(jié)合的方法處理卷煙主側(cè)流煙氣中的雜環(huán)胺，衍生后采用氣相色譜-氮磷檢測器，檢測到AaC、Trp-p-1、IQ和PHIP 11。Moldoveanu等人采用固相萃取方法對卷煙主流煙氣進(jìn)行處理，并采用氣相色譜-質(zhì)譜分析了非極性的雜環(huán)胺化合物：哈爾滿，降哈爾滿，AaC和MeAaC 47。上述方法都存在

21、前處理復(fù)雜、檢測靈敏度較低或并不具普適性等缺點(diǎn)，因此改進(jìn)現(xiàn)有前處理方法并建立一種對所有雜化胺類化合物都適用且較為簡單的、選擇性好、檢測靈敏度高的分析方法，具有重要意義。二、 卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類的分析1 儀器與試劑 API4000質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Cerulean SM450 直線式吸煙機(jī)（Cerulean，Ltd.）；Borgwalt-KC RM20H 20孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)（Borgwaldt KC，Inc.）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-210（瑞士步琪有限公司）；Milli-Q50超純水儀（美國MILLIPORE公司）；KQ

22、-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pH計(上海雷磁儀器公司)；CP2245電子天平（感量0.0001g，德國Sartorius公司）。2-amino-9H -pyrido2,3-b indole(AC, CAS:26148-68-5); 2-amino-3-methyl- 9H- pyrido 2,3-b indole (MeAC, CAS: 68006-83-7), 3-amino-1,4- dimethyl-5H- pyrido4,3-b indole (Trp-p-1, CAS:62450-06-0), 3-amino-1-methyl-5H- pyrido4,3

23、-b indole (Trp-p-2, CAS:72254-58-1)和 2-amino- 3,4,7,8-tetramethylimidazo4,5-f quinoxaline (4,7,8 -TriMeIQx, CAS: 95896-78-9)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。除特別要求以外，均應(yīng)使用液相色譜純級試劑，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸胺、氨水（分析純）、鹽酸（分析純）；Oasis® MCX固相萃取柱（150mg，6mL, Waters公司）；0.45m有機(jī)相針式過濾器（上海安譜）。2卷煙主流煙氣中主要雜環(huán)胺類化合物的收集和前處理將卷煙樣品放置于（

24、22±1），相對濕度為（60±2）%的環(huán)境中平衡48h，然后選其平均重量在±0.02g范圍和平均吸阻在±49Pa/支范圍內(nèi)的煙支作為測試煙支。按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持續(xù)時間2s。對于直線式吸煙機(jī)，用直徑44mm的劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集5支卷煙的總粒相物，取收集10支卷煙的總粒相物的2張濾片置于100mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液；對于轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)，用直徑92mm的劍橋?yàn)V片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集20支卷煙的總粒相物，取收集20支卷煙的總粒相物的1張濾片

25、置于250mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液。超聲萃取30分鐘后，用移液管準(zhǔn)確移取25mL萃取液，上樣到已用10mL甲醇和10mL甲醇/5%鹽酸（v/v=20/80）溶液活化后的MCX固相萃取柱（150mg，6mL）上，令萃取液靠重力自然留下，保持流速在1-1.5mL/min左右。然后依次用10ml 水、10ml甲醇、10ml甲醇/氨水/水溶液（v/v/v=25/5/70）洗滌，最后用10ml 5氨水甲醇溶液(v/v)進(jìn)行洗脫，洗脫液加入50L內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻過濾后進(jìn)LC-MS/MS分析。3 液相色譜和質(zhì)譜條件3.1液相色譜條件：HPLC-MS/MS分析

26、所用分析柱為Agilent SB C18 （100mm×4.6mmi.d., 1.8m），柱溫：30 ；流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為甲酸/2mM甲酸銨緩沖溶液（pH= 4.5），梯度洗脫條件如表2所示，進(jìn)樣體積10L。表2 梯度洗脫條件時間（min）流速 (L/min)A (%)B (%)02009010520040601020040601520090103.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件：a) 離子源：電噴霧電離源（ESI）;b) 掃描方式：正離子掃描;c) 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；d) 電噴霧電壓：5500V；e) 氣簾氣壓力: 0.124Mpa；f) 輔助氣1壓力: 0.3

27、79 Mpa；g) 輔助氣2壓力: 0.345Mpa；h) 離子源溫度: 600.00i) 各化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間以及碰撞能量（CE）參見表3表3 質(zhì)譜檢測參數(shù)表化合物定量離子對(m/z)定性離子對(m/z)駐留時間（ms）CE（V）Trp-p-2198.1/181.0198.2/154.05035Trp-p-1212.1/195.1212.1/168.15038AC184.0/167.1184.0/140.05032Me AC198.1/181.0198.1/129.050354,7,8-TriMeIQx242.1/227.2242.1/145.25042圖2 為主流煙氣

28、中主要雜環(huán)胺在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的MRM色譜圖1- Trp-p-2、2- Trp-p-1、3- AC、4- MeAC圖2 主流煙氣中主要雜環(huán)胺在標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的MRM色譜圖4. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制4.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備母液取適量AC、MeAC、Trp-p-1和 Trp-p-2標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇分別配制成100g/mL儲備母液。于-18冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.2 一級混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別吸取AC、 MeAC、 Trp-p-1和 Trp-p-2標(biāo)準(zhǔn)儲備母液10mL，2mL、1mL和1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.3 二級混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液吸取一級混合

29、標(biāo)準(zhǔn)儲備液10mL至50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18冰箱中避光保存，有效期為3個月。4.4 內(nèi)標(biāo)儲備溶液取4,7,8-TriMeIQx標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100g/mL儲備液。于-18冰箱中避光保存，有效期為6個月。4.5 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液移取內(nèi)標(biāo)儲備溶液1mL至100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于-18冰箱中避光保存，有效期為3個月。4.6 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，95%甲醇水溶液定容。即配制成如表4所示的6級標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。表4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列 (ng/mL)化合物1#2#3#4#5#6#AC125102050MeAC0.20.412410T

30、rp-p-10.10.20.5125Trp-p-20.10.20.5125內(nèi)標(biāo)5555555. 主流煙氣中主要雜環(huán)胺的定性和定量測定待測目標(biāo)物選擇1個母離子，2個或2個以上子離子，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)的相對保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對應(yīng)的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品譜圖中各組分特征離子的相對豐度與濃度臨近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對應(yīng)的特征離子的相對豐度進(jìn)行比較，當(dāng)相對豐度>50%時，允許偏差±20%，當(dāng)相對豐度在20-50%時，允許偏差±25%，當(dāng)相對豐度在10-20%時，允許偏差±30%，當(dāng)相對豐度<10%時，允許偏差±

31、50%。配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分析進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)不小于0.99，內(nèi)標(biāo)法定量。主流煙氣中雜環(huán)胺類化合物的釋放量由式（1）計算得出，結(jié)果以納克每支表示：（1）式中：m - 每支卷煙主流煙氣雜環(huán)胺類化合物的釋放量，單位為納克每支(ng/cig)。A - 溶液中雜環(huán)胺類化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）。L - 溶液的體積，單位為毫升（mL）n - 煙支數(shù)量，單位為支。三、討論1 超聲萃取溶劑選擇 雜環(huán)胺的堿性較弱，所以采用強(qiáng)酸水溶液和甲醇的混溶液進(jìn)行提取，本實(shí)驗(yàn)中以5%的鹽酸溶液混合不同比例的甲醇，按體積比將甲醇的比例分別設(shè)為0、10、20和50。如圖3所示，但5%的鹽酸

32、與甲醇的比例超過80/20時，萃取結(jié)果基本不變。同時由于甲醇比例越高，萃取出的干擾成分就越多，因此確定萃取的溶液為甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)。 1- 5%鹽酸溶液、 2- 甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=10/90)、 3- 甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=20/80)、 4- 甲醇/5%鹽酸溶液(v/v=50/50)圖3 萃取溶劑中甲醇比例的影響2 不同萃取方式的影響本實(shí)驗(yàn)中比較了兩種提取方式對煙氣中雜環(huán)胺類化合物測定的影響。一種超聲萃取，一般來說，超生萃取的優(yōu)勢是耗時較短，萃取效率較高，缺點(diǎn)是超聲時間如果較長，溫度會上升，有機(jī)溶劑的揮發(fā)的可能性增大，另外萃取的干擾成分也較多。另一種是

33、震蕩萃取，震蕩萃取時發(fā)熱較少，但要較長時間的萃取，才能萃取完全。圖4顯示了超聲萃取30分鐘和震蕩萃取60分鐘的比較結(jié)果，由圖中可見對于煙氣中雜環(huán)胺類化合物，超聲萃取的效率高于震蕩萃取。故采用超聲萃取方式來提取目標(biāo)物。圖4 不同萃取方式的影響3 不同超聲萃取時間的影響本實(shí)驗(yàn)中選擇了超聲15min，30min，45min和60min四個條件來確定超聲萃取的時間。由圖5可見，在超聲30min后，目標(biāo)物的含量基本不變，為節(jié)約時間和防止引入更多的干擾成分，我們選擇30min為萃取時間。圖5 不同超聲萃取時間的影響4 固相萃取過程中待測目標(biāo)物的保留情況本實(shí)驗(yàn)所采用的Waters Oasis MCX固相萃取

34、小柱屬混合型陽離子交換固相萃取柱，對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，具有雙重保留模式：離子交換和反相，適合與復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的除雜和純化。為考察固相萃取過程中目標(biāo)物的保留情況，分別收集固相萃取各個步驟的溶液，進(jìn)液質(zhì)分析，考察保留情況。圖6顯示了整個固相萃取過程，實(shí)驗(yàn)中分別收集上樣、淋洗和洗脫等步驟的流出液。如圖所示，待測的4種雜環(huán)胺在上樣和凈化過程中幾乎都保留在固相萃取小柱上，只有極微量（<0.02%）的流失，在固相萃取過程中目標(biāo)物與雜質(zhì)達(dá)到較好的分離；同時由于內(nèi)標(biāo)在固相萃取過程中發(fā)生了部分流失，所以選擇將目標(biāo)物洗脫后再加內(nèi)標(biāo)，由圖7可見，目標(biāo)物在萃取

35、過程中幾乎全部轉(zhuǎn)移到洗脫后的溶液中，從而保證了定量的準(zhǔn)確性。圖6 固相萃取凈化過程1- 上樣 、2- 水淋洗 3- 甲醇淋洗、4- 氨水甲醇淋洗液淋洗 5- 5%氨水甲醇溶液洗脫圖7 固相萃取過程中待測目標(biāo)物的分布5 待測目標(biāo)物洗脫體積的確定增大洗脫體積能夠保證把目標(biāo)物盡可能全部洗脫出來，但目標(biāo)物的濃度也會隨著體積增大而降低，而減小洗脫體積可能產(chǎn)生洗脫不完全的風(fēng)險，因而選擇適宜的洗脫體積時需二者兼顧。實(shí)驗(yàn)中分別收集0-5mL、5-10mL、10-15mL、15-20mL和20-25mL洗脫液進(jìn)行測定。如圖8所示，當(dāng)采用10mL洗脫液洗脫時，已有99.5%以上的待測目標(biāo)物被洗脫，因此選擇10mL

36、洗脫液進(jìn)行洗脫。1- 5mL、 2- 10mL、3- 15mL、4- 20mL、5- 25mL圖8 洗脫液洗脫體積的影響6 流動相pH值的影響本實(shí)驗(yàn)中液相色譜分析采用的是水-乙腈體系，水相為甲酸/甲酸銨緩沖溶液。為研究緩沖溶液pH對色譜峰響應(yīng)的影響，分別配制了pH值為3.5、4、4.5、5的緩沖溶液。如圖9所示，當(dāng)緩沖溶液pH值為4.5時，色譜峰的整體響應(yīng)最高。Aera圖9 流動相pH值的影響7 前處理后樣品的穩(wěn)定性為考察樣品的穩(wěn)定性，將前處理后的樣品密閉于2mL色譜小瓶中，4冷藏保存，分別在前處理當(dāng)天和第3、5、7天進(jìn)樣。如圖10所示，4種雜環(huán)胺在三日內(nèi)穩(wěn)定性良好。圖10 前處理后樣品的穩(wěn)定

37、性8 不同類型吸煙機(jī)的影響 目前行業(yè)內(nèi)常用的吸煙機(jī)有轉(zhuǎn)盤式和直線式兩種，實(shí)驗(yàn)比較了兩種類型吸煙機(jī)對測定結(jié)果的影響。對于直線式吸煙機(jī)，抽吸10支卷煙，兩張44mm劍橋?yàn)V片捕集，50mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL；對于轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)，抽吸20支卷煙，一張92mm劍橋?yàn)V片捕集，100mL5%鹽酸/甲醇溶液(80/20)萃取，上樣25mL。如圖11所示，轉(zhuǎn)盤式和直線式吸煙機(jī)測定結(jié)果相對偏差小于5%，無顯著差異。圖11 不同類型吸煙機(jī)的影響9 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢測限 如表5所示，本實(shí)驗(yàn)中Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環(huán)胺線性良好，通過計算10次最低濃度標(biāo)準(zhǔn)

38、溶液測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到檢出限分別為0.09、0.08、0.56、0.12ng/cig。表5 四種雜環(huán)胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和定量檢出限化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線R2檢出限（ng/cig）定量限（ng/cig）Trp-p-2Y=0.307x+0.007210.99980.090.29Trp-p-1Y=0.373x+0.1820.99960.080.27ACY=0.404x+0.1370.99980.561.85MeACY=0.348x+0.04050.99880.120.3910 精密度和回收率 由表6可見Trp-p-2、Trp-P-1、AaC、MeAaC等四種雜環(huán)胺的日內(nèi)精密度結(jié)果分別為7.45%、6.3

39、7%、7.93%和7.10%，日間精密度結(jié)果分別為8.88%、7.33%、7.73%和9.31%?；厥章史謩e在85.1107.7%、83.295.6%、89.6110.7%和81.0100.4%之間。表6 四種雜環(huán)胺的精密度和回收率化合物日內(nèi)精密度/%（ n=6）日間精密度/%（ n=5）添加濃度/(ng/mL)回收率范圍/%Trp-p-27.458.880.492.9107.71.085.197.92.096.2101.8Trp-p-16.377.330.487.795.61.083.292.02.087.596.5AC7.937.734.089.6110.710.0100.7109.920

40、.0101.2110.3MeAC7.109.310.887.6100.42.085.992.34.081.094.211 雜環(huán)胺比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果本項(xiàng)目開展了比對實(shí)驗(yàn)，選擇了參比（烤煙型）卷煙、參比（混合型）卷煙、白沙、紅塔山、中南海5個牌號的卷煙進(jìn)行分析。鄭州煙草研究院、云南紅塔集團(tuán)、河南中煙工業(yè)公司、廣東中煙工業(yè)公司、湖北中煙工業(yè)公司和國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心等6家實(shí)驗(yàn)室參與了比對實(shí)驗(yàn)。每個牌號卷煙各家實(shí)驗(yàn)室均測定5次，表中列出了6家實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果。由表7結(jié)果可見，6家實(shí)驗(yàn)室的RSD除一個為12.12%外，均小于10%，說明各家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果較為接近，再現(xiàn)性好。表7 雜環(huán)胺比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果ng/cig

41、化合物鄭州院紅塔河南廣東湖北質(zhì)檢平均值RSD參比（烤煙型)Trp-p-20.71 0.80 0.75 0.75 0.80 0.77 0.76 4.48%Trp-p-11.04 0.89 1.04 1.00 1.03 0.98 1.00 5.77%AC10.10 8.98 9.70 10.49 9.79 9.89 9.82 5.11%MeAC1.28 1.14 1.26 1.17 1.26 1.18 1.21 4.91%參比（混合型）Trp-p-20.790.84 0.81 1.01 0.84 0.93 0.87 9.71%Trp-p-11.221.34 1.23 1.15 1.25 1.22

42、1.24 5.09%AC15.4714.81 15.61 17.51 15.72 15.06 15.70 6.07%MeAC1.321.56 1.38 1.34 1.38 1.34 1.39 6.49%白沙Trp-p-20.920.92 0.91 0.95 0.92 0.87 0.92 2.95%Trp-p-11.250.98 1.26 1.44 1.26 1.19 1.23 12.12%AC12.3612.10 12.05 12.14 12.46 12.35 12.24 1.38%MeAC1.431.22 1.45 1.25 1.42 1.40 1.36 7.46%紅塔山Trp-p-20.9

43、0.91 0.95 1.00 0.92 0.89 0.93 4.58%Trp-p-11.461.42 1.40 1.48 1.47 1.39 1.44 2.61%AC14.9914.55 14.98 14.41 15.17 15.08 14.86 2.08%MeAC1.661.60 1.63 1.41 1.56 1.55 1.57 5.51%中南海Trp-p-21.291.23 1.29 1.031.28 1.15 1.21 8.58%Trp-p-11.611.49 1.63 1.571.62 1.55 1.58 3.45%AC17.9617.43 17.80 19.2717.85 16.84

44、 17.86 4.51%MeAC1.731.65 1.75 1.451.72 1.62 1.65 6.78%12 卷煙樣品的測定結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果的比較本項(xiàng)目測定了20個牌號的國內(nèi)外卷煙，測定結(jié)果見表8。由表中結(jié)果可見Trp-p-2的含量為0.393.25ng/cig、Trp-p-1的含量為0.612.44ng/cig、AC的含量為9.0141.40ng/cig、MeAC的含量為0.703.53ng/cig。文獻(xiàn)55-56中報道了卷煙主流煙氣中雜環(huán)胺的含量范圍：Trp-p-2的含量為0.821.1ng/cig、Trp-p-1的含量為0.290.48ng/cig、AC的含量為25260ng/ci

45、g、MeAC的含量為237ng/cig， 兩者結(jié)果進(jìn)行比較，本實(shí)驗(yàn)樣品Trp-p-2和Trp-p-1的含量范圍與文獻(xiàn)比較接近，AC和MeAC的含量因所測試樣品的差異而處于含量范圍的低端。表8 卷煙主流煙氣中四種雜環(huán)胺的測定結(jié)果（ng/cig）編號卷煙類型Trp-p-2Trp-p-1ACMeAC1#國外混合型2.582.2732.603.362#國外混合型1.991.9423.602.543#國外混合型1.951.9623.792.394#國外混合型2.101.9125.642.325#國外混合型3.252.4441.403.536#國外混合型1.501.4220.802.077#國外混合型0.

46、390.619.010.788#國內(nèi)混合型1.471.4718.871.739#國內(nèi)混合型1.621.7818.901.9710#國內(nèi)混合型1.561.4617.721.6511#國內(nèi)烤煙型1.231.1612.641.4112#國內(nèi)烤煙型1.250.9814.311.5413#國內(nèi)烤煙型1.161.049.011.0714#國內(nèi)烤煙型1.681.2214.571.3715#國內(nèi)烤煙型1.421.3414.321.4216#國內(nèi)烤煙型1.331.1510.751.2117#國內(nèi)烤煙型1.161.3511.061.2218#國內(nèi)烤煙型1.831.7331.402.6319#國內(nèi)烤煙型1.971.

47、7433.303.3720#國內(nèi)烤煙型0.660.759.330.70參考文獻(xiàn)1 Felton J S, Knize M G., Salmon C P, Malfatti M A, Kulp K S. Human exposure to heterocyclic amine food mutagens/carcinogens: Relevance to breast cancer. Environ. Molecular Mutagen. 2002, 39: 112 -118.2 Fei X Q, Li C , Yu X D, Chen H Y. Determination of heteroc

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